人AB型血清培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)擴(kuò)增人臍血源基質(zhì)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、造血微環(huán)境(Hematopoietic inductive microenvironment，HIM)是造血干細(xì)胞產(chǎn)生、增殖和分化發(fā)育的場(chǎng)所，基質(zhì)細(xì)胞是造血微環(huán)境的重要組成成分，不僅與造血干細(xì)胞的自我更新、增殖、分化和歸巢現(xiàn)象關(guān)系密切，而且對(duì)血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后產(chǎn)生重要影響。人臍血源基質(zhì)細(xì)胞(human stromal cells derived from umbilical cord blood，hUCBDSCs)可促進(jìn)骨髓

2、造血微環(huán)境損傷的修復(fù)，具有取材方便、細(xì)胞增殖活性高和免疫原性弱等優(yōu)點(diǎn)。已有研究表明，從人臍血標(biāo)本中分離的基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)直接接觸促進(jìn)造血干細(xì)胞自我更新、增殖和分化的作用，基質(zhì)細(xì)胞可以分泌多種促進(jìn)造血的細(xì)胞因子如TPO、GM-CSF和SCF等，可增強(qiáng)造血干細(xì)胞的骨髓遷移和發(fā)育，并可以分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分(extracellular matrix，ECM)參與造血微環(huán)境的組成。然而，臍帶血來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞存在數(shù)量有限，且其體外擴(kuò)增培養(yǎng)必須嚴(yán)格依賴于

3、特定的胎牛血清等缺點(diǎn)，這阻礙了人臍血源基質(zhì)細(xì)胞的臨床應(yīng)用。理想的體外培養(yǎng)體系應(yīng)避免使用動(dòng)物血清成分帶來(lái)臨床應(yīng)用上的風(fēng)險(xiǎn)。本研究嘗試以人AB型血清培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)人臍血基質(zhì)細(xì)胞，獲得了較好的效果，建立了一種穩(wěn)定的體外培養(yǎng)擴(kuò)增人臍血基質(zhì)細(xì)胞方法，為人臍血基質(zhì)細(xì)胞的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。主要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.人臍血基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的動(dòng)態(tài)觀察：在培養(yǎng)48～96 h后，可見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞已貼壁。貼壁細(xì)胞呈不規(guī)則形并可見(jiàn)胞漿突起形成，大約1周后貼

4、壁細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)明顯的分裂增殖，并可見(jiàn)CFU-F集落形成，繼續(xù)培養(yǎng)至CFU-F集落融合形成單層細(xì)胞。經(jīng)HE染色觀察，人臍血基質(zhì)細(xì)胞呈梭形、圓形或不規(guī)則形，核為圓形或橢圓形，CFU-F集落內(nèi)細(xì)胞排列呈放射狀和渦流狀。集落間細(xì)胞相互連接、交錯(cuò)成片。 2.15％人AB型血清和bFGF細(xì)胞因子濃度對(duì)人臍血基質(zhì)細(xì)胞CFU-F的影響：15％人AB型血清能有效支持臍血基質(zhì)細(xì)胞在體外的擴(kuò)增培養(yǎng)。在0～10μg/L范圍內(nèi)bFGF的濃度越高，形成的集

5、落數(shù)也越多，但當(dāng)其濃度大于10μg/L時(shí)，對(duì)人臍血基質(zhì)細(xì)胞形成集落數(shù)的刺激作用無(wú)明顯增加。 3.臍血基質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測(cè)：應(yīng)用免疫組化染色，檢測(cè)了Vimentin、CD34、TdT、CD45和CK等在臍血基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)。生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第1-2次傳代細(xì)胞用于進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，結(jié)果表明人臍血基質(zhì)細(xì)胞的表型為Vimentin(+)、CD34(+)、TdT(一)、CD45(二)和CK(一)。 主要結(jié)論：成功建立一種人AB型血