骨髓基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合幾丁質(zhì)凝膠體外聯(lián)合培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、可注射性水凝膠是國(guó)際上近幾年興起的一種相對(duì)新穎的軟骨組織工程材料，它提供了一類新的細(xì)胞固定機(jī)制，可注射性材料用于軟骨缺損修復(fù)的優(yōu)勢(shì)在于材料與修復(fù)細(xì)胞之間嵌合連接好、塑形容易，細(xì)胞和生長(zhǎng)因子能與材料充分均勻混合，且能通過(guò)關(guān)節(jié)鏡或其它微創(chuàng)方式操作，安全、有效、費(fèi)用低。本實(shí)驗(yàn)利用可注射性水凝膠——幾丁質(zhì)作為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞載體，在體外進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，為構(gòu)建組織工程軟骨組織提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料與方法： 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年SD大鼠10只，

2、雄鼠體重120-140g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 2主要試劑和儀器幾丁質(zhì)(SIGMA公司)，DMEM(GIBCO公司產(chǎn)品)，新生牛血清(GIBCO公司產(chǎn)品)，percoll梯度分離液(PHARMACIA公司產(chǎn)品密度：1.073g/m)，胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF-I、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1(Sigma公司)、維生素C、地塞米松，CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡。 3幾丁質(zhì)凝膠的制備在10℃下，將幾丁質(zhì)(SIGMA公司)1

3、0g放入研缽中，加丙酮40ml研磨10min；邊研磨邊緩緩加入冷濃HCl400ml，充分研磨，使呈糊狀.于4℃放置24h，之后用玻璃棉過(guò)濾，將濾液緩緩加入到盛有2000ml體積分?jǐn)?shù)50％乙醇的燒杯中，邊加邊劇烈攪拌，然后靜置，待膠態(tài)幾丁質(zhì)析出后去除清液，收集膠態(tài)幾丁質(zhì)；用蒸餾水沖洗膠態(tài)幾丁質(zhì)至pH7，以蒸餾水定容至1000ml，冷藏備用. 4BMSCs的分離，培養(yǎng)及鑒定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用4％的戊巴比妥鈉麻醉后，在無(wú)菌條件下抽取股骨骨髓

4、(抗凝處理)，用DMEM倍比稀釋(1:1)，緩慢加入預(yù)先準(zhǔn)備好的含percoll梯度分離液的試管中，1200r/min，離心20min，收取單個(gè)核細(xì)胞的界面層，DMEM洗滌，反復(fù)2次，加入含10％新生牛血清/DMEM的24孔板內(nèi)，在37℃，5％CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，48小時(shí)去除未黏附細(xì)胞，亦更換培養(yǎng)液，隔天換液，0.25％胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。OLYMPUS倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。待原代骨髓干細(xì)胞增殖貼壁成單層后

5、，收集細(xì)胞。取部分細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色，茜素紅染色和Mallory染色。 5傳代培養(yǎng)、誘導(dǎo)、鑒定 取第四代細(xì)胞分為三組，實(shí)驗(yàn)組按1×105接種于24孔培養(yǎng)液，分別加入2mlDMEM無(wú)血清特定培養(yǎng)液(地塞米松0.4mg/L，TGF-β110ng/ml、IGF-I50ng/50ul，維生素C50ng/L)，并與2倍量幾丁質(zhì)凝膠混勻，培養(yǎng)誘導(dǎo)；對(duì)照組以同樣濃度接種于24孔培養(yǎng)板，加入同樣DMEM無(wú)血清特定培養(yǎng)液培養(yǎng)誘導(dǎo)；空白

6、對(duì)照組同樣濃度接種于24孔培養(yǎng)板單純培養(yǎng)。內(nèi)置玻片，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周2次換液。倒置顯微鏡觀察，分別在誘導(dǎo)后7、14、21d取出載玻片，免疫組化檢測(cè)BMSCS分化的軟骨細(xì)胞分化的Ⅱ型膠原以及HE染色和阿爾新藍(lán)染色。 6透射電鏡觀察收集原代BMSCs細(xì)胞和經(jīng)培養(yǎng)誘導(dǎo)14dBMSCs細(xì)胞，于1.5ml離心管中，2％戊二醛固定24h，常規(guī)超薄切片透射電鏡觀察細(xì)胞超微形態(tài)。 7Ⅱ型膠原的含量分析聯(lián)合培養(yǎng)7，1

7、4，21d隨機(jī)取免疫組化染色切片，每組20張。在Linzux成像系統(tǒng)下對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)量其輝度，計(jì)算百分比。 8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異性顯著性采用t檢驗(yàn)。 結(jié)果： 1電鏡檢查透射電鏡下，細(xì)胞表面的褶皺狀小突起是軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)重多特征之一。可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞呈圓形或橢圓形，具有典型的褶皺狀小突起，胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量很多，排列緊密，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池略多為擴(kuò)張，充滿顆粒物質(zhì)

8、，線粒體少，核內(nèi)常染色體增多。對(duì)照組軟骨細(xì)胞較小且少，成梭形。 2組織學(xué)檢測(cè)HE染色：BMSCs傳代第四代后，細(xì)胞外形呈現(xiàn)短柱狀及三角狀，胞核呈淡紅色。聯(lián)合培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)變短，呈四方形，表現(xiàn)為“鋪路石”樣排列，阿爾新蘭染色示細(xì)胞外基質(zhì)分泌旺盛，呈堿性基質(zhì)，染蘭色。 3Ⅱ型膠原的免疫組化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)中7，14，21dBMSCs誘導(dǎo)分化的軟骨細(xì)胞分泌的Ⅱ型膠原免疫組化均為陽(yáng)性，可見(jiàn)標(biāo)黃色的顆粒分布于細(xì)胞漿內(nèi)?；|(zhì)染色較對(duì)

9、照組更為明顯。 4Ⅱ型膠原的含量分析見(jiàn)表1。討論利用組織工程學(xué)方法構(gòu)建透明軟骨來(lái)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損是骨科領(lǐng)域正在積極探討的課題。 組織工程的研究主要包括三個(gè)方面：種子細(xì)胞的離體培養(yǎng)、細(xì)胞外基質(zhì)替代物、生物材料的研究及組織工程化的組織的構(gòu)建。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞因其來(lái)源不受限，取材方便，對(duì)供體損傷小，易于分離培養(yǎng)，體外增殖能力強(qiáng)，大量傳代培養(yǎng)后仍具成軟骨能力；同時(shí)，BMSCs具有多潛能性，根據(jù)環(huán)境而有不同的分化路途，在各自解剖位置

10、，分別形成透明軟骨、軟骨下骨，而且BMSCs易于基因修飾調(diào)整，用于表達(dá)所需的細(xì)胞因子，所以BMSCs作為軟骨組織工程的一種重要的種子細(xì)胞越來(lái)越被人們所重視。同時(shí)，獲得優(yōu)良的組織工程軟骨與支架性質(zhì)的優(yōu)劣是分不開(kāi)的。 可注射性水凝膠是一種相對(duì)新穎的軟骨組織工程材料，其優(yōu)勢(shì)在于材料與修復(fù)組織之間嵌合連接好，塑形容易，細(xì)胞和(或)生長(zhǎng)因子與材料充分均勻混合，且能通過(guò)關(guān)節(jié)或其它微創(chuàng)方式操作，治療簡(jiǎn)單、安全、有效、費(fèi)用低，不會(huì)遺留明顯瘢痕，

11、同時(shí)凝膠樣材料適合于對(duì)細(xì)胞施加壓力，凝膠的應(yīng)變力對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)力刺激。 幾丁質(zhì)是一種天然生物高分子多聚糖，具有良好的生物相溶性和生物降解性，所有降解產(chǎn)物對(duì)人體均無(wú)毒性、無(wú)刺激、無(wú)免疫原性，無(wú)致突變效應(yīng)，且該材料具有廣譜抑制細(xì)菌、霉菌的作用。 本實(shí)驗(yàn)中BMSCs在幾丁質(zhì)凝膠中表現(xiàn)出良好的生存能力、黏附性、增殖能力和再分化，經(jīng)軟骨的誘導(dǎo)后，透射電鏡下細(xì)胞具有典型的褶皺狀小突起，細(xì)胞器發(fā)達(dá)，表現(xiàn)出軟骨細(xì)胞良好的表型。HE染色，細(xì)

12、胞成圓形或橢圓形，阿爾新蘭染色細(xì)胞外基質(zhì)分泌旺盛。Ⅱ型膠原免疫組化檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組均為陽(yáng)性，可見(jiàn)棕黃色顆粒分布于細(xì)胞漿，以軟骨細(xì)胞周圍明顯，成條索狀分布，與周圍組織分界明顯，基質(zhì)染色較對(duì)照組更為明顯。Ⅱ型膠原含量分析，實(shí)驗(yàn)組明顯優(yōu)于對(duì)照組(p＜0.05)。 實(shí)驗(yàn)證明，可注射性幾丁質(zhì)水凝膠能為BMSCs向軟骨誘導(dǎo)分化提供所需的三維空間，有利于BMSCs向軟骨細(xì)胞定向分化及細(xì)胞外基質(zhì)合成。同時(shí)，其具有的取材廣泛、安全性高、廣譜的抑菌作用