蠶絲人工韌帶復(fù)合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 利用自制的蠶絲人工韌帶支架，多種方法對(duì)表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行改性，觀察對(duì)比不同分組間種子細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)情況，為組織工程化人工韌帶支架材料與種子細(xì)胞復(fù)合提供一種理想的方法。
　　 方法:
　　 蠶絲人工韌帶支架材料，采用胰酶、碳酸鈉聯(lián)合脫膠，稱重測(cè)韌帶脫膠率，以EDC（1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亞胺）/NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)作為交聯(lián)劑進(jìn)行膠原的交聯(lián)，酶標(biāo)儀法測(cè)其交聯(lián)度。采用熒光顯微鏡、掃描電鏡

2、觀察蠶絲脫膠及與交聯(lián)膠原復(fù)合后的表面結(jié)構(gòu)變化。
　　 把韌帶支架分為試驗(yàn)組、參照組和空白對(duì)照組。參照組蠶絲人工韌帶與膠原結(jié)合形成蠶絲-膠原結(jié)合韌帶支架，不做交聯(lián)處理;試驗(yàn)組采用EDC/NHS對(duì)蠶絲-膠原結(jié)合韌帶支架材料進(jìn)行交聯(lián);空白組未作任何處理。兔的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Marrowmesenchymalstemcells，MSCs)全血貼壁法培養(yǎng)至第八代，通過(guò)CD34、CD44、CD50免疫組化及流式細(xì)胞儀進(jìn)行干細(xì)胞檢測(cè)，調(diào)整細(xì)胞

3、密度為1×106/L，分別種植于三種支架材料上，對(duì)三種材料表面培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行了熒光顯微鏡、掃描電鏡及酶標(biāo)儀的檢測(cè)。比較不同分組間細(xì)胞粘附、增殖生長(zhǎng)情況。
　　 結(jié)果:
　　 采用胰酶、碳酸鈉聯(lián)合脫膠，能將絲膠基本去除，脫膠率29％左右。當(dāng)EDC濃度為3g/L時(shí)，交聯(lián)度最大。熒光顯微鏡下未脫膠蠶絲表面比較完整;脫膠蠶絲結(jié)構(gòu)變得蓬松，表面光滑，絲素纖維暴露。SEM觀察，未脫膠蠶絲表面粗糙不平，絲膠包繞在絲素纖維周圍;脫膠完全

4、的蠶絲表面很光滑，可見(jiàn)單根的絲素纖維。熒光倒置顯微鏡及SEM下復(fù)合膠原后的韌帶可見(jiàn)，膠原呈一薄層分布在韌帶表面，呈不規(guī)則的線狀突起，色澤較白。交聯(lián)后膠原-蠶絲韌帶成蜂窩狀。
　　 全血貼壁法體外培養(yǎng)的BMSC，檢測(cè)CD34陰性、CD44、CD50、STRO-1陽(yáng)性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34+細(xì)胞占10％左右;CD44+占42％左右，表現(xiàn)為干細(xì)胞特性。熒光顯微鏡下，未交聯(lián)膠原-蠶絲韌帶細(xì)胞數(shù)目較少，細(xì)胞未見(jiàn)舒展;交聯(lián)后的膠原-蠶絲人

5、工韌帶，蠶絲表面粗糙，細(xì)胞粘附率較高，舒展充分，蠶絲之間的間隙模糊。SEM下見(jiàn)，交聯(lián)后的蠶絲人工韌帶與細(xì)胞貼合緊密，細(xì)胞伸展充分，有較多的觸角伸出，明顯優(yōu)于其它組。經(jīng)單因素方差分析，試驗(yàn)組與參照組、空白對(duì)照組比較P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞能夠向多種組織細(xì)胞分化，在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的增殖能力，是種子細(xì)胞的理想選擇。
　　 2.膠原蛋白具有良好的生物相容性，是一種良好的蠶

6、絲表面修飾劑。EDC毒性很低，可作為良好的交聯(lián)劑。
　　 3.經(jīng)過(guò)EDC/NHS交聯(lián)的蠶絲-膠原結(jié)合韌帶支架材料，能夠顯著提高細(xì)胞黏附率。
　　 意義:
　　 隨著人們物質(zhì)文化水平的不斷提高和體育事業(yè)的蓬勃發(fā)展，韌帶損傷病例呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)。韌帶損傷后，往往需要韌帶重建手術(shù)治療。目前韌帶移植材料有①自體韌帶;②異體韌帶;③人工韌帶，都存在來(lái)源少，免疫排斥及傳播疾病的缺陷。組織工程人工韌帶的發(fā)展，為治療韌帶損傷提