骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)椎間盤(pán)退變的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的: 椎間盤(pán)退變性疾病是腰背痛的主要原因，也是骨科最常見(jiàn)多發(fā)病。椎間盤(pán)發(fā)生退變后，間盤(pán)內(nèi)最重要的變化是髓核內(nèi)的膠原減少和蛋白多糖濃度的降低。目前針對(duì)此類(lèi)疾病的治療方法有保守治療和外科手術(shù)治療等，但都有一定缺陷。而利用人自體椎間盤(pán)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或干細(xì)胞移植到椎間盤(pán)，移植后能產(chǎn)生新的細(xì)胞外基質(zhì)，以此來(lái)逆轉(zhuǎn)椎間盤(pán)退變的過(guò)程是新的研究方向。隨著對(duì)干細(xì)胞的研究逐漸深入，我們認(rèn)識(shí)到骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化的潛能。本課題通過(guò)培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干

2、細(xì)胞，驗(yàn)證了其來(lái)源充足，取材方便，擴(kuò)增能力確切的各項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)。為此，我們采用纖維環(huán)穿刺法制造大鼠尾椎間盤(pán)退變模型的方法，然后將干細(xì)胞注入退變椎間盤(pán)中，通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)照，觀察骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植到大鼠退變的椎間盤(pán)后阻逆或修復(fù)椎間盤(pán)退變的效果。 方法: 本實(shí)驗(yàn)利用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，將大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞白骨髓血中分離、純化和培養(yǎng)，先選用2周齡大鼠斷頸處死，取其脛骨、股骨，并去除兩干骺端，PBS沖洗髓腔，收集沖洗液，放入等體積的淋巴細(xì)胞分

3、離液，吸取中間乳白色層面細(xì)胞懸液，與5倍體積的PBS混合后，離心，獲取2×10<'6>/ml，放于20％DMEM培養(yǎng)液中，置入37℃、飽和濕度、5％CO<,2>培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后換液，72h后細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)基(細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)到80％～90％)，每3天換液，1傳4分瓶，此為傳一代，取第3～4代作為注射用。并制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行干細(xì)胞的貼壁率檢測(cè)。從中選取3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，進(jìn)行骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察和生物學(xué)性能鑒定。 將W

4、istar大鼠隨機(jī)分成四組：正常組(A組)、模型組(B組)、模型組+干細(xì)胞/藻酸鹽組(C組)、模型組+藻酸鹽組(D組)。每組九只大鼠，每組分二周組、四周組、八周組三個(gè)亞組，平均每亞組三只大鼠。制造大鼠尾的椎間盤(pán)退變模型(B組)：顯微鏡下用21號(hào)針頭穿刺破壞纖維環(huán)并抽吸髓核組織。C組：在椎間盤(pán)穿刺抽吸髓核組織后立即注入干細(xì)胞/藻酸鹽復(fù)合物，細(xì)胞濃度為1×10<'6>/ml。D組：在椎間盤(pán)穿刺抽吸髓核組織后立即注入單純等量的藻酸鹽作為C組的

5、對(duì)照。 觀察骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在植入椎間盤(pán)后是否能夠延緩或修復(fù)椎間盤(pán)退變。分別于2、4、8周觀察大鼠尾椎間盤(pán)組織形態(tài)學(xué)變化，免疫組化法測(cè)定纖維環(huán)組織中Ⅰ型膠原的變化。 結(jié)果: 1、原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)顯示大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有活躍的增殖倍增能力。 2、組織學(xué)檢測(cè)顯示A組椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)形態(tài)正常：椎間盤(pán)高度正常，纖維環(huán)排列整齊，髓核結(jié)構(gòu)正常；B組椎間盤(pán)退變模型組顯示椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)破壞明顯：椎間盤(pán)高度下降，纖維環(huán)排列紊亂，髓

6、核基質(zhì)含量減少；C組注入干細(xì)胞組顯示椎間盤(pán)整體結(jié)構(gòu)較B組明顯恢復(fù)：椎間高度較B組好轉(zhuǎn)，纖維環(huán)排列較整齊，髓核基質(zhì)成分增多；D組形態(tài)學(xué)改變與B組相似。 3、纖維環(huán)中工型膠原免疫組織化學(xué)分析：A組為正常，顯示纖維環(huán)排列整齊，纖維環(huán)中Ⅰ型膠原表達(dá)較多。B組纖維環(huán)結(jié)構(gòu)破壞明顯，序列紊亂，Ⅰ型膠原表達(dá)減少。C組早期纖維環(huán)結(jié)構(gòu)破壞明顯，序列紊亂，Ⅰ型膠原表達(dá)減少，2周后逐漸好轉(zhuǎn)：纖維環(huán)組織形態(tài)學(xué)排列逐漸整齊，Ⅰ型膠原表達(dá)逐漸增多，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)