人臍血源基質(zhì)細(xì)胞對(duì)造血損傷模型小鼠體內(nèi)造血調(diào)控作用的研究.pdf

1、目的:本課題采用密度梯度離心收集獲得人臍血單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells，MNCs)，經(jīng)過傳代培養(yǎng)得到人臍血源基質(zhì)細(xì)胞(humanumbilical cord blood-derived stromal cells，hUCBDSCs)、人臍血源間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells,hUCBDMSCs):觀察兩類細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)增

2、殖特點(diǎn)，流式細(xì)胞儀技術(shù)測(cè)得兩類細(xì)胞的表面抗原;經(jīng)DiI標(biāo)記后分別輸注入造血功能損傷模型小鼠模型體內(nèi)，動(dòng)態(tài)檢測(cè)小鼠靜脈血紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、血紅蛋白濃度，了解外周血血象恢復(fù)情況;動(dòng)態(tài)檢測(cè)兩類細(xì)胞對(duì)骨髓造血微環(huán)境的修復(fù)情況，深入比較人臍血源基質(zhì)細(xì)胞與其間充質(zhì)干細(xì)胞恢復(fù)造血的能力，達(dá)到確立在臨床可使用人臍血源基質(zhì)細(xì)胞即可恢復(fù)造血這一理論體系提供了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)，解決了臨床上因使用促造血生長(zhǎng)因子帶來(lái)的副作用及產(chǎn)生昂貴費(fèi)用這一實(shí)際問題;也給長(zhǎng)期

3、探索早期造血恢復(fù)方法的血液學(xué)工作者帶來(lái)了新的思路。
　　方法:1.細(xì)胞分離與培養(yǎng):采用密度梯度離心收集獲得臍血單個(gè)核細(xì)胞，用DMEM/F-12、MSCM培養(yǎng)體系分別進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞的體外培養(yǎng)，得到純度較高的hUCBDSCs及hUCBDMSCs，倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察兩類細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況及形態(tài)特點(diǎn)，利用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)兩類細(xì)胞表面抗原的表達(dá);2.DiI標(biāo)記兩類細(xì)胞進(jìn)行示蹤;3.建立小鼠造血損傷模型:X射線輻照BALB/c小鼠(總劑量5

4、Gy，吸收率100cGy/min，時(shí)間5min，距離100cm);4.實(shí)驗(yàn)分組:將造型損傷模型小鼠隨機(jī)分為3組:hUCBDSCs組、hUCBDMSCs組、對(duì)照組;5.分別經(jīng)小鼠尾靜脈移植注入hUCBDSCs（1.0×106/只）、hUCBDMSCs（1.0×106/只）、生理鹽水(0.2ml)，動(dòng)態(tài)記錄三組小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況等一般生理狀態(tài)及生存狀況，計(jì)算各組生存率;分別于3d、7d、14d取靜脈血檢測(cè)紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、血紅蛋

5、白，了解外周血血象恢復(fù)情況;3d、7d、14d分別進(jìn)行骨髓涂片觀察兩類細(xì)胞在小鼠骨髓歸巢情況、骨髓活檢了解兩類細(xì)胞對(duì)骨髓造血微環(huán)境損傷的修復(fù)作用;6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，各組間采用單因素方差分析，兩組間數(shù)據(jù)比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α設(shè)定為0.05，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;計(jì)數(shù)資料采用率描述。
　　結(jié)果:1.采用密度梯度離心可獲得單個(gè)核細(xì)

6、胞，經(jīng)體外傳代培養(yǎng)得到純度較高的hUCBDMSCs及hUCBDSCs; MSCM培養(yǎng)體系培養(yǎng)原代細(xì)胞，24h后細(xì)胞呈不規(guī)則形、類圓形，分布均勻，胞體小，透明;48h后細(xì)胞貼壁，數(shù)量增多，部分細(xì)胞開始向兩極伸展;7-12d細(xì)胞以梭形為主，集落樣分布，細(xì)胞內(nèi)顆粒少，透明，細(xì)胞間界限清楚;14-16d可鋪滿瓶底;傳代后細(xì)胞形態(tài)一致，生長(zhǎng)增殖較原代快，經(jīng)1-2d潛伏期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，呈均勻細(xì)長(zhǎng)梭形，6-7d后進(jìn)入平臺(tái)期。F-12培養(yǎng)體系培養(yǎng)原

7、代細(xì)胞，24h后細(xì)胞呈類圓形、不規(guī)則形，分布均勻，胞質(zhì)透明;48h后細(xì)胞數(shù)量增多，貼壁生長(zhǎng);7-12d細(xì)胞集落樣分布，形態(tài)多樣，以類圓形、扁形為主，細(xì)胞間界限清楚，胞質(zhì)透明，顆粒少;傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)較原代快，經(jīng)1-2d潛伏期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，呈圓形或扁形，6d后進(jìn)入平臺(tái)期。兩類細(xì)胞生長(zhǎng)曲線變化趨勢(shì)一致:傳代后1-2d細(xì)胞處于潛伏期，生長(zhǎng)增殖緩慢;48h后細(xì)胞指數(shù)增長(zhǎng)，增殖、活力旺盛，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;6-7d后細(xì)胞生長(zhǎng)增殖明顯減緩，由對(duì)數(shù)生

8、長(zhǎng)期進(jìn)入平臺(tái)期。hUCBDSCs對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期前期增殖速度較hUCBDMSCs緩慢，后期增長(zhǎng)速度快于hUCBDMSCs。2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原的表達(dá)，hUCBDSCs:Lm:10.58，CD29:3.36，CD106:7.65，CD44:54.4，F(xiàn)n:47.07, STRO-1:0.57,CD45:76.39, C3D4:21.63; hUCBDMSCs: Lm:8.5,CD29:40.2, CD106:11.7,CD44:18.

9、8, Fn:5.3, STRO-1:29.3, CD45:-0.8,C3D4:2.6。3.模型的建立:非致死劑量輻照BALB/c小鼠（劑量5Gy，能量6MeV，距離100cm，吸收率100cGy/min，時(shí)間5min），可造成小鼠急性造血功能損傷。4.DiI標(biāo)記第三代hUCBDMSCs、hUCBDSCs，兩類細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下顯橙紅色熒光;形態(tài)與普通倒置相差顯微鏡一致;兩類細(xì)胞標(biāo)記率均為100％。5.血象的恢復(fù)情況:動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血常規(guī)

10、，結(jié)果顯示移植后3d，三組小鼠白細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)及血紅蛋白濃度均無(wú)顯著差異（P＞0.05）;移植后第7d，hUCBDSCs組及hUCBDMSCs組白細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞、血紅蛋白恢復(fù)情況均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且hUCBDSCs組白細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞均顯著高于hUCBDMSCs組(P＜0.05)，血紅蛋白無(wú)濃度明顯差異（P＞0.05）。移植后14d，hUCBDSCs組及hUCBDMSCs組白細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞、血紅

11、蛋白恢復(fù)均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且hUCBDSCs組白細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)及血紅蛋白濃度顯著高于hUCBDMSCs組（P＜0.05），紅細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)明顯差異（P＞0.05）。6.兩類細(xì)胞的歸巢:動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)骨髓示蹤細(xì)胞，結(jié)果顯示兩類細(xì)胞均可在移植后期穩(wěn)定定植于骨髓，且hUCBDSCs組較hUCBDMSCs組先歸巢于骨髓。7.骨髓病理切片:移植后3d三組小鼠骨髓均出現(xiàn)造血功能抑制，有核細(xì)胞增生不良，非造血細(xì)胞比例增加;移植后7d三組小鼠造

12、血功較前均有恢復(fù)，有核細(xì)胞成簇分布，hUCBDSCs組、hUCBDMSCs組骨髓增生均優(yōu)于對(duì)照組，且hUCBDSCs組優(yōu)于hUCBDMSCs組;移植后14d對(duì)照組骨髓造血功能恢復(fù)情況較前無(wú)明顯改變，hUCBDSCs組與hUCBDMSCs組造血功能明顯恢復(fù)，有核細(xì)胞增生活躍，人臍血源基質(zhì)細(xì)胞組可見大量巨核細(xì)胞。提示臍血干細(xì)胞移植可作為修復(fù)放/化療后造血微環(huán)境損傷的一種安全有效方法，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。
　　結(jié)論:1.利用密度梯度

13、離心，體外培養(yǎng)可獲得高純度的hUCBDMSCs及hUCBDSCs。2.hUCBDSCs表面表達(dá)抗原:Lm:10.58，CD29:3.36, CD106:7.65, CD44:54.4, Fn:47.07, STRO-1:0.57,CD45:76.39，C3D4:21.63。hUCBDMSCs表面表達(dá)抗原:Lm:8.5，CD29:40.2，CD106:11.7, CD44:18.8, Fn:5.3, STRO-1:29.3, CD45:-