人臍血源基質(zhì)細(xì)胞新型微環(huán)境對(duì)殘留白血病細(xì)胞的作用及機(jī)制探討.pdf

1、殘留白血病細(xì)胞或稱白血病微小殘留病(minimal residual disease； MRD)是白血病治療達(dá)到完全緩解后體內(nèi)殘留的白血病細(xì)胞，多處于GO期，對(duì)化療藥物不敏感，是白血病難治、復(fù)發(fā)的主要根源。目前，尚未發(fā)現(xiàn)真正的白血病細(xì)胞特異性抗原，雖然采用多種方法聯(lián)合但均不能滿意殺滅和有效清除患者體內(nèi)的MRD，而且采用化療新藥和更強(qiáng)烈的聯(lián)合化療方案多對(duì)正常造血功能造成嚴(yán)重的損傷。針對(duì)MRD，目前尚缺乏有效低毒的清除措施，已成為嚴(yán)重束縛白

2、血病治療取得突破性進(jìn)展的關(guān)鍵性障礙之一。探索不同來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞所構(gòu)建造血微環(huán)境對(duì)MRD的作用及機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步降低白血病復(fù)發(fā)、提高白血病長(zhǎng)期生存率，具有重要的理論和實(shí)踐意義。 造血微環(huán)境( hematopoietic inductive microenvironment，HIM)是調(diào)控造血干/祖細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的“土壤”，骨髓基質(zhì)細(xì)胞( bone marrow stromal cells，BMSCs)是構(gòu)成造血微環(huán)境的重要成分。白血病細(xì)

3、胞是惡性克隆性增殖的造血細(xì)胞，其生存、分化、增殖同樣依賴HIM的調(diào)控，白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞微環(huán)境有助于白血病細(xì)胞的庇護(hù)、生長(zhǎng)和逃避化療藥物的殺傷，是MRD產(chǎn)生的重要機(jī)制之一，因此從造血微環(huán)境入手探索清除MRD的有效方法是白血病治療的新的切入點(diǎn)。 本課題組的既往研究證實(shí)：在適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子組合的條件下，可成功培養(yǎng)、擴(kuò)增人臍血來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞(human umbilical cord blood-derived stromal cells

4、，hUCBDSCs)；擴(kuò)增后的hUCBDSCs在細(xì)胞組成和免疫表型上與人骨髓基質(zhì)細(xì)胞(human bone marrowstromal cells，hBMSCs)相似，可以分泌多種細(xì)胞因子，具有與hBMSCs相似的支持和重建造血功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，可稱為人臍血源基質(zhì)細(xì)胞造血微環(huán)境( hematopoieticinductive microenvlronment from human umbilical cord blood-derived

5、stromal cells,hUCBDSC-HIM)。 人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞分別與hUCBDSC-HIM和正常人骨髓基質(zhì)細(xì)胞造血微環(huán)境( hBMSC-HIM)共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)：hUCBDSC-HIM具有較hBMSC-HIM對(duì)Jurkat細(xì)胞更強(qiáng)的抑制作用和促凋亡作用。 鑒于此，本實(shí)驗(yàn)將系統(tǒng)、深入地研究不同來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞所模擬造血微環(huán)境對(duì)殘留耐藥Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞周期分布、增殖、分化、凋亡及藥物敏感性等

6、生物學(xué)特性的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。 研究?jī)?nèi)容及方法： 1.不同來(lái)源骨髓基質(zhì)細(xì)胞微環(huán)境對(duì)Jurkat細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 實(shí)驗(yàn)分組：①Jurkat細(xì)胞懸浮培養(yǎng)組；②Jurkat細(xì)胞/正常hBMSCs共培養(yǎng)組；③Jurkat細(xì)胞/白血病hBMSCs共培養(yǎng)組。 倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察Jurkat細(xì)胞與BMSCs的位相關(guān)系；MTT法檢測(cè)Jurkat細(xì)胞的黏附率；Transwell法檢測(cè)Jurkat細(xì)胞遷

7、移侵襲功能變化；CCK-8法、Real-timeQ-PCR法、Western blot法檢測(cè)Jurkat細(xì)胞增殖特性的變化；流式細(xì)胞儀法檢測(cè)Jurkat細(xì)胞周期及DNR攝藥量變化；流式細(xì)胞儀法、透射電鏡、Real-time Q-PCR法、Western blot法檢測(cè)Jurkat細(xì)胞的凋亡；NBT還原法檢測(cè)Jurkat細(xì)胞分化水平變化。 2.殘留耐藥Jurkat細(xì)胞的培養(yǎng)及其耐藥機(jī)制的初步探討 體外分離培養(yǎng)初發(fā)急性淋巴細(xì)

8、胞白血病患者BMSCs以模擬骨髓造血微環(huán)境，在與Jurkat細(xì)胞長(zhǎng)期共培養(yǎng)的過(guò)程中選用含DNR50ng/ml的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，絕大部分Jurkat細(xì)胞漂浮死亡。極少數(shù)殘留的Jurkat細(xì)胞逐漸恢復(fù)活力并獲得抗藥能力，可以在DNR終濃度為50ng/ml的培養(yǎng)液中存活、增殖，將該細(xì)胞記為JurkaUDNR細(xì)胞。 CCK-8法檢測(cè)Jurkat及Jurkat/DNR細(xì)胞的增殖特性及對(duì)多種化療藥物的耐藥系數(shù)；流式細(xì)胞

9、儀法檢測(cè)Jurkat及Jurkat/DNR細(xì)胞周期及DNR攝藥量；通過(guò)檢測(cè)Caspase-Glo3/7活性、Real-time Q-PCR法、Westem blot法檢測(cè)Jurkat及Jurkat/DNR細(xì)胞的凋亡相關(guān)指標(biāo)；Real-time Q-PCR法檢測(cè)Jurkat及Jurkat/DNR細(xì)胞多藥耐藥相關(guān)基因：MDR1及MRP mRNA的表達(dá)。 3.人臍血源基質(zhì)細(xì)胞對(duì)殘留耐藥Jurkat細(xì)胞的作用 實(shí)驗(yàn)分組：①Jur

10、kat/DNR細(xì)胞懸浮培養(yǎng)組；②Jurkat/DNR細(xì)胞/JF.常hBMSCs共培養(yǎng)組；③Jurkat/DNR細(xì)胞/hUCBDSCs共培養(yǎng)組；④Jurkat/DNR細(xì)胞/白血病hBMSCs共培養(yǎng)組(僅在檢測(cè)對(duì)IDA敏感性時(shí)設(shè)定)。 收集懸浮培養(yǎng)及共培養(yǎng)10d的Jurkat/DNR細(xì)胞，檢測(cè)其增殖、細(xì)胞周期分布、凋亡、分化、對(duì)IDA藥物敏感性及多藥耐藥基因MRDl mRNA表達(dá)水平的變化。 結(jié)果： 1.倒置顯微鏡及

11、掃描電鏡觀察：隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，正常hBMSCs及白血病hBMSCs黏附、龕合、包裹Jurkat細(xì)胞，對(duì)共培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞具有一定的屏蔽作用，在一定程度上影響其生物學(xué)特性： 1.1黏附、遷移作用：白血病hBMSCs對(duì)Jurkat細(xì)胞的黏附、趨化作用強(qiáng)于正常hBMSCs； 1.2增殖曲線：正常hBMSCs對(duì)Jurkat細(xì)胞的增殖抑制作用強(qiáng)于白血病hBMSCs； 1.3細(xì)胞周期分布：白血病hBMSCs共培養(yǎng)組Ju

12、rkat細(xì)胞GO/G1+G2/M期細(xì)胞比例明顯增高；正常hBMSCs共培養(yǎng)組S+G2/M期細(xì)胞比例明顯增高； 1.4凋亡：白血病hBMSCs抑制Jurkat細(xì)胞凋亡，而正常hBMSCs促Jurkat細(xì)胞凋亡； 1.5細(xì)胞分化：白血病hBMSCs對(duì)共培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞的促分化作用弱于正常hBMSCs； 1.6對(duì)DNR的攝藥量：共培養(yǎng)組Jurkat細(xì)胞的攝藥量顯著低于懸浮培養(yǎng)組，其中白血病hBMSCs共培養(yǎng)組Jur

13、kat細(xì)胞的攝藥量最低。 2嵌合于基質(zhì)細(xì)胞層中的Jurkat細(xì)胞在DNR的持續(xù)刺激作用下逐步產(chǎn)生耐藥性，獲得殘留耐DNR的Jurkat細(xì)胞。 Jurkat/DNR細(xì)胞與Jurkat細(xì)胞相比有以下特點(diǎn)： 2.1增殖曲線：Jurkat/DNR細(xì)胞較Jurkat細(xì)胞的增殖速度明顯減緩 2.2細(xì)胞周期分布：GO/G1期細(xì)胞比例增高；異二倍體細(xì)胞比例增高； 2.3凋亡：發(fā)生自發(fā)凋亡的細(xì)胞明顯減少；

14、 2.4 DNR攝藥量：?jiǎn)蝹€(gè)Jurkat/DNR細(xì)胞內(nèi)平均藥物濃度明顯減低； 2.5對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥； 2.6多藥耐藥相關(guān)基因：Jurkat/DNR細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到MDRl mRNA表達(dá)；MRPmRNA表達(dá)水平升高。 3.人臍血源基質(zhì)細(xì)胞對(duì)殘留耐藥Jurkat/DNR細(xì)胞的作用 3.1增殖曲線：hUCBDSCs對(duì)Jurkat/DNR細(xì)胞的增殖抑制作用強(qiáng)于正常hBMSCs； 3.2細(xì)胞周期分

15、布：hUCBDSCs及正常hBMSCs均可促Jurkat/DNR細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，hUCBDSCs共培養(yǎng)組GO/G1期細(xì)胞比例最低；共培養(yǎng)組Jurkat/DNR細(xì)胞中異二倍體比例顯著降低； 3.3凋亡和分化：hUCBDSCs對(duì)共培養(yǎng)Jurkat/DNR細(xì)胞自發(fā)凋亡及分化的促進(jìn)作用均強(qiáng)于正常hBMSCs； 3.4對(duì)IDA的敏感性：hUCBDSCs及hBMSCs均可提高Jurkat/DNR對(duì)IDA的敏感性，而hUCBDSCs

16、要優(yōu)于hBMSCs； 3.5 MDR1 mRNA的表達(dá)：共培養(yǎng)組Jurkat/DNR細(xì)胞MDRl mRNA表達(dá)水平低于懸浮培養(yǎng)組，其中hUCBDSCs共培養(yǎng)組的表達(dá)水平最低。 結(jié)論： 1.白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞微環(huán)境有助于白血病細(xì)胞的庇護(hù)、生長(zhǎng)和逃避化療藥物的殺傷；正常骨髓源基質(zhì)細(xì)胞較白血病源骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)Jurkat細(xì)胞具有更強(qiáng)的促凋亡、分化及抑制增殖的作用。同時(shí)，正常hBMSCs可以增加Jurkat細(xì)胞對(duì)DNR的