白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)柔紅霉素作用下Jurkat細(xì)胞凋亡及基因表達(dá)的影響.pdf

1、背景與目的：白血病細(xì)胞是惡性克隆性增殖的造血細(xì)胞，其生存、分化、增殖均與骨髓基質(zhì)細(xì)胞密切相關(guān)。已有研究表明，骨髓基質(zhì)細(xì)胞與白血病細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，前者能保護(hù)白血病細(xì)胞逃避化療藥物殺傷，且骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞的保護(hù)作用有賴于兩種細(xì)胞直接接觸和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的形成。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，抑制白血病細(xì)胞增殖、凋亡是骨髓基質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)白血病細(xì)胞逃避化療藥物殺傷的重要途徑。但上述結(jié)論主要來(lái)源于正常骨髓基質(zhì)細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞株的相關(guān)研究。而白血病患者骨髓造血

2、實(shí)質(zhì)細(xì)胞惡性克隆性增生時(shí)伴隨有骨髓基質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能的變化。我室前期研究發(fā)現(xiàn)，白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞存在粘附功能、細(xì)胞因子分泌、細(xì)胞外基質(zhì)成分的異常。白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞異常分泌的細(xì)胞因子對(duì)白血病細(xì)胞的作用非常復(fù)雜，可以是支持或抑制，協(xié)同或拮抗，還可以被逐級(jí)放大，形成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)。但白血病患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞與白血病細(xì)胞共培養(yǎng)后可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞異常表達(dá)哪些細(xì)胞因子?這些細(xì)胞因子對(duì)白血病細(xì)胞影響如何?這些情況目前未見(jiàn)系統(tǒng)研究報(bào)道。白血病細(xì)胞與

3、骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后，白血病細(xì)胞能夠逃避化療藥物的殺傷，說(shuō)明白血病細(xì)胞的表型發(fā)生了改變，而細(xì)胞表型的改變由基因表達(dá)變化決定。因此，克隆白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞保護(hù)的白血病細(xì)胞差異表達(dá)基因?qū)τ陉U明骨髓基質(zhì)細(xì)胞保護(hù)白血病細(xì)胞逃避化療藥物殺傷的分子機(jī)理有重要意義。本課題在體外分離培養(yǎng)正常人、初治急性白血病患者骨髓原代基質(zhì)細(xì)胞，對(duì)比研究了它們對(duì)人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞對(duì)抗化療藥物-柔紅霉素(DNR)殺傷作用的影響及其可能機(jī)制；在此基

4、礎(chǔ)上應(yīng)用抑制消減雜交等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，著重研究了白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞抑制DNR誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡過(guò)程中Jurkat細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的變化，并進(jìn)一步分析了差異表達(dá)基因在骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)Jurkat細(xì)胞保護(hù)過(guò)程中的意義。CRIF1(CR6-interactingfactor1)是實(shí)驗(yàn)中Jurkat細(xì)胞表達(dá)上調(diào)基因之一，是一種新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子。而CRIF1與白血病細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)系如何?目前未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本課題進(jìn)一步研究了與

5、白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后，Jurkat細(xì)胞CRIF1及其級(jí)聯(lián)基因Gadd45的表達(dá)水平變化，并探討它們與Jurkat細(xì)胞G0/G1期阻滯的關(guān)系。 方法：①采用Percoll體外分離正常人、初治急性白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞；②應(yīng)用DNR體外作用于Jurkat細(xì)胞，研究DNR誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的規(guī)律，AnnexinV/PI雙標(biāo)法流式細(xì)胞儀檢測(cè)Jurkat細(xì)胞凋亡率，PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布；③

6、應(yīng)用掃描電鏡初步觀察了共培養(yǎng)條件下骨髓基質(zhì)細(xì)胞與Jurkat細(xì)胞的位相特征；④Jurkat細(xì)胞分別與正常骨髓基質(zhì)細(xì)胞、白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，研究正常骨髓基質(zhì)細(xì)胞、白血病患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)Jurkat細(xì)胞對(duì)抗DNR殺傷作用的影響及其可能機(jī)制；⑤采用抑制性消減雜交技術(shù)等分子生物學(xué)方法建立白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞保護(hù)的Jurkat細(xì)胞差異表達(dá)基因的cDNA文庫(kù)；并對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行初步鑒定與分析；⑥應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞

7、保護(hù)的Jurkat細(xì)胞CRIF1及其級(jí)聯(lián)基因Gadd45的mRNA表達(dá)的改變。 結(jié)果：①0.1～2.0μmol/L濃度范圍DNR作用一定時(shí)間后，Jurkat細(xì)胞的凋亡率隨藥物濃度的增加與作用時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。②骨髓基質(zhì)細(xì)胞與Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，Jurkat細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞粘附生長(zhǎng)，共培養(yǎng)24hrs時(shí)，掃描電鏡下可見(jiàn)部分細(xì)胞嵌入骨髓基質(zhì)細(xì)胞層。③正常骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組與單獨(dú)懸浮培養(yǎng)組比較，DNR誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞凋亡

8、率有顯著降低(P＜0.005)，白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組Jurkat細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步下降；④DNR處理后，兩共培養(yǎng)組Jurkat細(xì)胞G0/G1期比例高于懸浮培養(yǎng)組；而兩共培養(yǎng)組之間無(wú)明顯差異。⑤成功地建立了白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞保護(hù)的Jurkat細(xì)胞上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因的cDNA文庫(kù)；經(jīng)反向Northern雜交，初步篩選克隆到30個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因和22個(gè)下調(diào)差異表達(dá)基因cDNA片段；并進(jìn)行了測(cè)序和同源性分析，52個(gè)差異表達(dá)克隆在Gen

9、Bank基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)中均可找到同源性在86％以上的序列，屬已知基因。但它們中多數(shù)尚無(wú)相關(guān)深入的功能研究報(bào)道。在30個(gè)上調(diào)表達(dá)克隆中，功能上較肯定的基因有：組蛋白(histone1，H2a)、細(xì)胞色素C氧化酶V亞基(cytochromecoxidasesubunitVb，COX5B)、CRIF1(CR6interactingfactor1)、半乳糖凝集素-1(Galectin-1)、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞單位1(NADHdehy

10、drogenase1)、核糖體蛋白大亞基18a(RibosomalproteinL18a)；下調(diào)表達(dá)克隆中，功能上較肯定的基因有核糖體蛋白小亞基11(RibosomalproteinS11)。這些基因功能主要與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞能量代謝相關(guān)。⑥本研究發(fā)現(xiàn)Jurkat細(xì)胞CRIF1mRNA有一定量的基礎(chǔ)表達(dá)，與白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后，Jurkat細(xì)胞CRIF1mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比顯著上調(diào)，同時(shí)伴有其級(jí)聯(lián)基因Gadd45

11、mRNA的表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論：一定濃度的DNR在體外可誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡，在一定的劑量范圍內(nèi)隨濃度、作用時(shí)間的延長(zhǎng)Jurkat細(xì)胞凋亡率升高，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)、時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系；正常骨髓基質(zhì)細(xì)胞、白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞均可抑制DNR誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞凋亡，白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞的抑制效應(yīng)強(qiáng)于正常骨髓基質(zhì)細(xì)胞組，這種抑制效應(yīng)可能與其阻滯Jurkat細(xì)胞于G0/G1期有關(guān)；白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞能誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞基因發(fā)生差異表達(dá)；本研究

12、有效地克隆了骨髓基質(zhì)細(xì)胞抑制DNR誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡過(guò)程中Jurkat細(xì)胞相關(guān)差異表達(dá)基因，這些結(jié)果為進(jìn)一步在基因水平探討白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞保護(hù)白血病細(xì)胞逃避化療藥物殺傷的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)；研究進(jìn)一步在基因水平證實(shí)了Jurkat細(xì)胞CRIF1基因及其級(jí)聯(lián)基因Gadd45的表達(dá)上調(diào)，提示白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞抑制DNR誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞凋亡可能與CRIF1、Gadd45高表達(dá)有關(guān)。本研究表明，G0/G1期阻滯可能是白血病骨髓基質(zhì)細(xì)