二氫楊梅素對人白血病Jurkat細胞增殖與凋亡的影響及機制.pdf

1、目的:探討二氫楊梅素（dihydromyricetin,DMY）對人急性T淋巴細胞白血病Jurkat細胞增殖及凋亡的影響，并從mTOR/自噬途徑的角度探討其可能的作用機制。
　　方法:體外培養(yǎng)人急性T淋巴細胞白血病Jurkat細胞，用含不同濃度（20、40、60、80和100mg/L）的DMY和5％胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)Jurkat細胞12、24和48小時。用60mg/L的DMY和10mmol/L細胞自噬抑制劑3

2、-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）共同處理Jurkat細24小時。四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）比色法用來檢測細胞活力并計算細胞增殖抑制率，流式細胞術(shù)用來檢測細胞凋亡并計算細胞凋亡率，采用透射電鏡觀察Jurkat細胞自噬體形成等超微結(jié)構(gòu)。采用Western Blot檢測Jurkat細胞中自噬相關(guān)基因Beclin1、LC3和p62的表達。采用實時定量PCR和West

3、ern Blot檢測Jurkat細胞中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（Mammaliantarget of rapamycin,mTOR）mRNA的表達。
　　結(jié)果：
　　1.DMY顯著抑制了Jurkat細胞的增殖(P﹤0.05)，呈現(xiàn)劑量和時間依賴性，在12、24和48小時時間點的藥物半數(shù)抑制濃度(50% inhibition concentration,IC50)逐漸降低，IC50分別為217、155和92mg/L，最佳作用濃度

4、和時間是60mg/L處理24小時。
　　2.DMY能以劑量和時間依賴的方式誘導Jurkat細胞的凋亡(P﹤0.05)，最佳作用濃度和時間是60mg/L處理24小時。
　　3.對照組Jurkat細胞的細胞形態(tài)正常，呈不規(guī)則形，細胞核呈圓形或橢圓形，核膜和核仁清晰可見，核染色質(zhì)均勻分布，細胞質(zhì)中可發(fā)現(xiàn)大量的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體等細胞器，可見少量自噬泡或自噬體。DMY(60mg/L)處理24小時組Jurkat細胞多呈不規(guī)則形，細

5、胞核稀疏成網(wǎng)狀，細胞核內(nèi)可發(fā)現(xiàn)部分染色質(zhì)固縮，部分線粒體出現(xiàn)空泡化，其他細胞器部分腫脹，少部分細胞膜出現(xiàn)破裂，細胞腫脹明顯，細胞質(zhì)中可發(fā)現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體和單層膜的自噬溶酶體，其中包含有處在不同降解階段的胞漿成分或細胞器；與對照組比較，DMY(60mg/L)處理24小時組細胞中雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體和單層膜的自噬溶酶體的數(shù)量及自噬泡占胞質(zhì)總面積的百分率顯著性增加(P﹤0.05)。
　　4.與對照組比較，DMY(60mg/L)處理

6、24小時組Jurkat細胞中自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3-Ⅱ的表達顯著上調(diào)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值顯著增加，而p62的表達顯著降低(P﹤0.05)。
　　5.與對照組比較，DMY(60mg/L)處理24小時組Jurkat細胞中mTOR mRNA和蛋白的表達均顯著降低(P﹤0.05)。
　　6.自噬抑制劑3-MA部分取消了DMY抑制Jurkat細胞增殖和誘導Jurkat細胞凋亡的作用(P﹤0.05)。
　　結(jié)