Disulfiram聯(lián)合Cu對(duì)急性B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的殺傷作用及其分子機(jī)制的探討.pdf

1、研究背景:急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是兒童最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是成人常見(jiàn)的急性白血病類型之一，發(fā)病年齡有兩個(gè)高峰期，即2至5歲的兒童和大于50歲的成人。ALL是一種起源于B或T系淋巴干祖細(xì)胞的異常克隆性疾病，在臨床、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)均具有高度異質(zhì)性。
　　雙硫侖(Disulfirum，DS)是一種臨床上應(yīng)用60多年的抗酗酒藥物，具有安全性好、毒副作用小且價(jià)格低廉

2、等多種特性。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究者發(fā)現(xiàn)DS對(duì)乳腺癌、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤、前列腺癌、黑色素瘤及結(jié)腸癌等多種實(shí)體瘤具有抗腫瘤作用。進(jìn)一步研究還表明DS是一種強(qiáng)的金屬離子螯合劑，能夠與多種金屬離子結(jié)合如Zn、Cu和Ni等形成復(fù)合物而增強(qiáng)其腫瘤殺傷作用。Cu是生物有機(jī)體一種必需的微量元素，其對(duì)于機(jī)體內(nèi)許多關(guān)鍵酶和轉(zhuǎn)錄因子活性的發(fā)揮具有至關(guān)重要的作用。許多研究發(fā)現(xiàn)，DS與Cu結(jié)合形成Cu(deDTC)2復(fù)合物能夠增強(qiáng)DS的腫瘤殺傷作用。雖然目前許多研

3、究者已經(jīng)證實(shí)了DS/Cu對(duì)許多惡性腫瘤包括實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)惡性疾病具有明顯的誘導(dǎo)凋亡和抑制增殖作用，但關(guān)于其對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)細(xì)胞作用的相關(guān)報(bào)道卻很少。由于ALL80-85％起源于B細(xì)胞，因此本研究將探討DS聯(lián)合Cu對(duì)B-ALL細(xì)胞（包括原代BALL細(xì)胞和Nalm6細(xì)胞株等）的殺傷作用及其分子機(jī)制。
　　細(xì)胞凋亡(Apoptosis)又稱程序性細(xì)胞死亡(Programmed Cell Death，PCD)，是指由基因調(diào)

4、控的細(xì)胞自主有序的死亡，對(duì)于維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育以及生物進(jìn)化等過(guò)程中起著重要作用。機(jī)體內(nèi)主要存在有三條途徑，一條是死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路（又稱外源性凋亡通路），另外一條是線粒體相關(guān)的凋亡通路（內(nèi)源性凋亡通路），最后是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，其中線粒體凋亡通路被認(rèn)為是最經(jīng)典的凋亡途徑。線粒體是細(xì)胞生命活動(dòng)控制中心，它既是細(xì)胞呼吸和氧化磷酸化的中心，又是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心。線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要是由于各種刺激的作用（包括陰性和陽(yáng)性刺激兩大

5、類，陰性刺激因子主要指的是由于各種生長(zhǎng)因子、激素和細(xì)胞因子的缺乏所致;陽(yáng)性刺激包括射線、藥物、細(xì)胞毒素、缺氧及病毒感染等多種因素）使線粒體內(nèi)膜上的通透性轉(zhuǎn)換孔道-線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（Mitochondrial permeability transition pore，MPTP）開(kāi)放，導(dǎo)致線粒體膜通透性發(fā)生改變、線粒體膜電位(mitochondrial membrance potential，MMP/△Ψ)下降，從而使線粒體膜間隙(mit

6、ochondrial intermembrane space，IMS)存在的大量的凋亡相關(guān)因子釋放至胞漿或胞核內(nèi)，包括細(xì)胞色素C、Smac/DIABLO、Htra2/Omi、IAPs、AIF及核酸內(nèi)切酶G(EndoG)等，從而誘導(dǎo)Caspases家族蛋白酶的活化，隨后Caspases切割其底物蛋白（這些蛋白大多是細(xì)胞內(nèi)的功能蛋白，在DNA修復(fù)、mRNA裂解、類固醇合成及細(xì)胞骨架重建等過(guò)程中起著重要的作用），并使這些作用底物蛋白的功能喪失

7、，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　Bcl-2家族蛋白根據(jù)其功能和BH結(jié)構(gòu)域數(shù)目的不同而分成三大亞類:1)抗凋亡蛋白亞家族:是指具有4個(gè)BH結(jié)構(gòu)域(BH1-4)的Bcl-2和Bcl-xL;2）促凋亡蛋白亞家族:指其蛋白結(jié)構(gòu)中包含有3個(gè)BH結(jié)構(gòu)域(BH1-3)的BAX和BAK等;3）僅具有BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白亞家族:如BID和BIM。這三類Bcl-2亞家族蛋白之間相互可形成同源或者異源二聚體，形成的二聚體是其家族蛋白之間功能實(shí)現(xiàn)和功能調(diào)節(jié)

8、的重要形式。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明Bcl-2家族蛋白在調(diào)控線粒體膜電位的變化中發(fā)揮著重要的的作用，從而在調(diào)控細(xì)胞凋亡作用方面發(fā)揮著不可或缺的角色。Bcl-xL、Bcl-2蛋白同屬于Bcl-2抗凋亡蛋白亞家族，兩者在細(xì)胞抗凋亡作用方面起著協(xié)同作用，共同抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命。Bcl-2基因（即B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一種原癌基因(oncogene)，最早是由Tsujimoto Y等于1984年在濾泡性非霍奇金淋巴瘤(Follicu

9、lar non-hodgkin's lymphoma)患者中首先發(fā)現(xiàn)的，是由于t(14;18)(q32;q21)染色體異位所致，其編碼的Bcl-2蛋白是體內(nèi)最重要的抗凋亡蛋白之一。
　　目前關(guān)于DS/Cu抗腫瘤作用的分子機(jī)制尚不完全明確，大部分研究主要圍繞蛋白酶體抑制和JNK/c-Jun通路的活化等方面，其他還包括抑制血管生成、Ras/PI3K/mTOR通路及抑制MDR蛋白等多方面。本研究團(tuán)隊(duì)前期也已經(jīng)證實(shí)了DS/Cu可通過(guò)抑制N

10、F-κB、活化JNK/c-Jun通路、誘導(dǎo)ROS在細(xì)胞內(nèi)蓄積從而誘導(dǎo)急性髓系白血病KG-1a細(xì)胞、急性T淋巴細(xì)胞白血病Molt4細(xì)胞和Brukitt淋巴瘤Raji細(xì)胞凋亡并抑制其增殖，且能逆轉(zhuǎn)HL-60耐藥細(xì)胞株對(duì)多柔比星的耐藥。目前有關(guān)DS/Cu對(duì)于急性B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的殺傷作用及其分子機(jī)制的研究尚少，有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡通路(mitochondrialpathway)在DS/Cu誘導(dǎo)其他腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制增殖過(guò)程中發(fā)揮著重要

11、的作用，因此本研究將以B-ALL細(xì)胞株(Nalm6細(xì)胞)和原代B-ALL細(xì)胞為研究對(duì)象，探討DS/Cu對(duì)急性B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞細(xì)胞Nalm6及原代B-ALL細(xì)胞的殺傷作用及其與線粒體凋亡通路之間的關(guān)系。
　　研究目的:本實(shí)驗(yàn)以急性B淋巴細(xì)胞白血病Nalm6細(xì)胞株、原代B-ALL細(xì)胞為研究對(duì)象，探討DS/Cu是否能誘導(dǎo)急性B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡并抑制其增殖;并進(jìn)一步研究DS/Cu誘導(dǎo)急性B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡與線粒體凋亡通路之

12、間的關(guān)系。
　　研究方法:1、用CCK-8(cell counting kit-8)法檢測(cè)不同濃度的(0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4uM) DS聯(lián)合0.5uM的Cu作用24h后對(duì)Nalm6細(xì)胞的增殖抑制作用，并用graph prism5軟件計(jì)算出相應(yīng)的IC50值。
　　2、用Annexin-Ⅴ/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的(0.025、0.05、0.1、0.2、0.5uM) DS聯(lián)合0

13、.5uM的Cu處理24h后對(duì)Nalm6、原代B-ALL細(xì)胞凋亡的影響。
　　3、用甲基纖維素集落形成（colony-forming unit，CFU）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DS及DS/Cu對(duì)Nalm6細(xì)胞集落形成能力的影響;
　　研究結(jié)果:1、CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DS/Cu對(duì)Nalm6細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用:作用24h后，單藥Cu(0.5uM)組的增殖抑制率為(6.39±4.93)％，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2.

14、244，P=0.088）。而不同濃度的DS/Cu對(duì)Nalm6細(xì)胞均具有顯著的增殖抑制作用，且呈劑量依賴性，0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4uM的DS聯(lián)合0.5uM的Cu對(duì)nalm6細(xì)胞的增殖抑制率分別為(22.29±6.69)％、(48.66±11.58)％、（50.83±12.61）％、（59.24±9.43）％、(62.74±9.17)％、（66.7±7.64)％、（72.13±7.94)％、（77.

15、86±5.43)％，單因素方差分析表明與對(duì)照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），由graph prism5軟件計(jì)算24h的IC50濃度為（0.18±0.08）uM。
　　2、流式細(xì)胞術(shù)Annexin-Ⅴ/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示DS/Cu對(duì)Nalm6細(xì)胞具有顯著的凋亡誘導(dǎo)作用:單藥Cu(0.5uM)組作用于Nalm6細(xì)胞24h后凋亡比例為（7.82±5.13）％，與對(duì)照組(8.34±6.23)％相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

16、義（t=0.112，P=0.916）。而不同濃度的(0.025、0.05、0.1、0.2、0.5uM)DS聯(lián)合0.5uM的Cu對(duì)Nalm6細(xì)胞具有顯著的凋亡誘導(dǎo)作用，凋亡比例分別為(17.84±7.68)％、（31.39±5.86)％、(60.41±13.87)％、（69.26±13.29)％、（81.37±12.72）％，經(jīng)單因素方差分析表明，不同濃度DS/Cu均能誘導(dǎo)Nalm6細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組（8.34±6.23）％比較差異具有統(tǒng)

17、計(jì)學(xué)意義(F=28.471)。進(jìn)一步用LSD方法比較不同濃度DS/Cu兩兩組間的細(xì)胞凋亡比例的差異結(jié)果顯示:0.025uM組與0.1、0.2、0.5uM組間均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.01）;0.05uM與0.1、0.2、0.5uM組間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）;0.1uM與0.5uM組間差異也具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;余各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)論:1、不同濃度的DS/Cu對(duì)Nalm6細(xì)胞具

18、有顯著的增殖抑制作用，且呈劑量依賴性，24h的IC50為(0.18±0.08) uM。
　　2、不同濃度的DS/Cu能顯著誘導(dǎo)B-ALL細(xì)胞（包括Nalm6和原代B-ALL細(xì)胞）凋亡，呈劑量依賴性;同時(shí)DS/Cu能明顯的抑制Nalm6細(xì)胞集落形成。
　　3、DS/Cu可以通過(guò)降低B-ALL細(xì)胞（包括Nalm6和原代B-ALL細(xì)胞）內(nèi)線粒體膜電位(MMP)水平，下調(diào)Bcl-2、Bcl-xl等線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，活化C