急性T淋巴細胞白血病的細胞及分子遺傳學研究.pdf

1、目的：
　　 1、系統分析1997年至2011年在本實驗室進行細胞遺傳學檢測的297例初診急性T淋巴細胞白血病(T-ALL)患者的臨床、實驗室及細胞遺傳學特征。2、檢測101例T-ALL患者中PHF6、NOTCH1、FBXW7、WT1基因突變以及64例T-ALL患者中SET-NUP214、SIL-TAL1、CALM-AF10融合基因重排的發(fā)生率，分析基因突變、染色體易位及隱匿性重排的相關性，闡述細胞和分子遺傳學異常在T-ALL發(fā)

2、生中的意義。3、我們建立了國際上第一株B淋系和髓系共表達的混合表型急性白血病細胞系JIH-5，并對其進行了較為完整的生物學鑒定。
　　 方法：
　　 1、297例T-ALL患者均采用骨髓細胞直接法或短期培養(yǎng)法制備染色體懸液，采用R顯帶進行核型分析，研究T-ALL患者中細胞遺傳學的特點。2、應用聚合酶鏈反應(PCR)擴增基因組DNA及PCR產物雙向測序的方法分析101例初診T-ALL患者中PHF6、NOTCH1、FBXW7

3、及WT1基因突變的發(fā)生率，同時采用巢式RT-PCR技術檢測64例T-ALL患者中SET-NUP214、SIL-TAL1、CALM-AF10融合基因重排的發(fā)生率，綜合分析基因突變與隱匿性重排對T-ALL患者臨床特征及預后的影響。3、收集1例混合表型急性白血病患者第二次完全緩解后再次復發(fā)時的骨髓標本，應用淋巴細胞分離液常規(guī)分離單個核細胞，在20％胎牛血清+80％IMDM培養(yǎng)基內長期培養(yǎng)；同時對新建細胞系進行相關鑒定，采用瑞氏及過氧化物酶(P

4、OX)染色觀察細胞形態(tài)學、電鏡觀察細胞超微結構、苔盼藍染色繪制生長曲線、流式細胞儀分析免疫表型、R帶分析染色體核型、PCR方法檢測EB病毒感染及支原體污染、STR-PCR檢測患者原代白血病細胞是否來自同一個體、集落形成能力的檢測，同時對JIH-5細胞系在裸鼠體內的致瘤性進行了研究。
　　 結果：
　　 1、單中心297例初診T-ALL患者的臨床、實驗室及細胞遺傳學特征
　　 297例T-ALL患者中，男性218例

5、，女性79例，男女比例為2.76:1，中位年齡23(4-76)歲，兒童114例，成人183例。按FAB診斷標準，297例T-ALL患者中L1型112例，L2型94例，未分類型(NOS)91例。三組病例的臨床和實驗室資料統計分析后發(fā)現，在發(fā)病年齡方面，L2L2>NOS(88.4>40.4>22.4×10

6、9/L)，L1組患者的中位WBC計數明顯高于L2組和NOS組；在中位血紅蛋白(Hb)、血小板(PLT)、乳酸脫氫酶(LDH)水平方面，三組之間均無統計學差異。
　　 297例T-ALL患者中，96.9％(288/297)的患者染色體核型分析成功，其中異常核型檢出率為42.4％。T-ALL異常核型檢出率及再現性異常發(fā)生率比較低，本組中出現≥2次的結構性異常有2p-，5q-，6q-，i(7q)，9p-，9q-，der(11)，12p

7、-，12q-，13q-，13q+，14q+，i(17q)，t(11；14)(p13；q11)，t(4；11)(q21；p15)，t(9；22)(q34；q11)，t(2；14)(p15；q32)，t(1；19)(q23；p13.3)。本組中亞二倍體檢出率為3.5％，47-50條的超二倍體檢出率為9.4％，>50條的超二倍體檢出率更低，為1.4％，四倍體檢出率為1.7％。
　　 2、T-ALL患者中常見基因突變及隱匿性重排的臨床和

8、實驗室特征
　　 101例T-ALL患者均進行常見基因突變檢測，中位年齡23(7-56)歲，男女性別比為4.3:1。101例患者中有14例(13.9％)存在PHF6基因突變，其中無義突變6例，移碼突變5例，錯義突變3例。PHF6基因突變集中發(fā)生于外顯子8、9、10，有4例突變發(fā)生在PHD鋅指結構域。101例T-A-LL患者中50例(49.5％)發(fā)生NOTCH1基因突變，涉及到HD結構域的突變有31例，占30.7％，其中錯義突變2

9、0例，移碼突變11例；涉及到PEST結構域的突變有12例，占11.8％，均為移碼突變：涉及到TAD區(qū)域的突變有1例，占1.0％，為插入突變；涉及到HD+PEST區(qū)域的有5例，占5.0％；涉及到HD+TAD區(qū)域的突變有1例，占1.0％。101例T-ALL患者中有10例發(fā)生FBXW7突變，突變率為9.9％，其中9例累及到9號外顯子，點突變5例，插入和缺失突變4例；1例累及到10號外顯子，為點突變。同時伴有FBXW7和NOTCH1基因突變的有

10、7例。101例T-ALL患者中有4例存在WT1基因突變，突變率為4.0％，其中3例突變累及7號外顯子，均為插入和缺失突變；1例點突變累及9號外顯子突變。
　　 64例T-ALL患者中有5例檢測到SET-NUP214融合基因轉錄本，發(fā)生率為7.8％，中位年齡為27(20-56)歲，男女性別比為4:1。有12例T-ALL患者檢測到SIL-TAL1融合基因轉錄本，發(fā)生率為18.8％，中位年齡為15(7-42)歲，男女性別比為3:1。S

11、IL-TAL1融合基因在成人T-ALL患者中的發(fā)生率為5.1％，在兒童T-ALL患者中的發(fā)生率為40％，兩者之間具有明顯的統計學差異(P=0.002)。64例T-ALL患者中均未檢測到CALM-AF10融合基因轉錄本，發(fā)生率為0％。其中61例核型分析成功的T-ALL患者中有30例檢出染色體異常，在31例核型正常的患者中有11例存在隱匿性染色體重排。
　　 PHF6突變型(PHF6-mut)與野生型(PHF6-wt)患者相比較，前

12、者外周血WBC計數較低(P<0.05)，PLT計數較高(P<0.05)，LDH水平較低(P<0.05)，骨髓原始細胞比例較高(P<0.05)，兩組的Hb水平、性別比沒有統計學差異。FBXW7-mut組與FBXW7-wt組患者相比較，前者外周血PLT計數較低(P<0.05)，兩組的WBC、Hb、LDH、骨髓原始細胞比例、性別比方面沒有統計學意義。SET-NUP214陽性組WBC計數明顯低于陰性組(P<0.05)，兩組在PLT計數、Hb水平

13、、LDH水平、骨髓原始細胞比例、性別比方面的差異無統計學意義。NOTCH1-mut組及NOTCH1-wt組、WT1-mut組及WT1-wt組、SIL-TAL1陽性組及陰性組在性別比、WBC計數、Hb水平、LDH水平、骨髓原始細胞比例方面的差異均無統計學意義。PHF6基因突變在成人患者中的發(fā)生率為19.4％，在兒童患者中的發(fā)生率為5.1％，兩者具有顯著差異(P<0.05)。SIL-TAL1陽性組在兒童中的發(fā)生率明顯高于陰性組(P<0.05

14、)。PHF6基因突變與NOTCH1、JAK1基因突變、SET-NUP214融合基因重排密切相關(P<0.01)。
　　 兒童T-ALL患者完全緩解(CR)率明顯高于成人T-ALL患者(85.2％vs60.5％，P<0.05)，PHF6-mut組中位無復發(fā)生存期明顯短于PHF6-wt組(11 vs24.8個月，P<0.05)。PHF6-mut組及PHF6-wt組、NOTCH1-mut組及NOTCH-wt組、FBXW7-mut組及F

15、BXW7-wt組、WT1-mut組及WT1-wt組、SET-NUP214陽性組與陰性組、SIL-TAL1陽性組與陰性組在CR率、總生存期方面的差異均無統計學意義(P>0.05)。
　　 3、混合表型急性白血病細胞系JIH-5的建立和鑒定
　　 JIH-5細胞在液體培養(yǎng)中呈單細胞樣懸浮生長，目前已于體外持續(xù)培養(yǎng)16月余，狀態(tài)良好，經液氮或-80℃低溫冰箱凍存、復蘇后仍能持續(xù)增殖，但增殖較緩慢，其倍增時間約為97小時。JIH

16、-5細胞瑞氏染色下胞體圓形，形態(tài)規(guī)則，胞核為圓形或類圓形，偶見折疊、凹陷，核染色質細致，部分可見核仁，胞漿量少至中等，染藍色，多不見顆粒，POX染色為陰性。電鏡觀察JIH-5細胞呈橢圓形，細胞表面有短小微絨毛，細胞質內可見豐富的線粒體、內質網、溶酶體等細胞器及空泡結構，胞核不規(guī)則，部分細胞可見核凹陷，多可見明顯的核仁。JIH-5細胞表達CD10、CD19、CD22、CD79a、CD13、CD33、CD15、MPO及CD41抗原，呈B淋系

17、/髓系抗原表達，也有部分巨核系抗原表達。經PCR檢測無EB病毒及支原體感染，STR-PCR示JIH-5細胞系來源于患者骨髓細胞，核型分析結果顯示JIH-5細胞保留了原代白血病細胞的染色體改變t(12；22)(p13；q11)，同時也出現了新的異常如t(2；2)(q33；q37)等染色體易位。JIH-5細胞能在半甲基纖維素中形成集落，在裸小鼠體內也具有一定的致瘤性。
　　 結論：
　　 1、本組297例T-ALL患者中，核

18、型異常率為42.4％，最常見的染色體結構異常累及14q11，檢出率為6.3％，其次是del(6q)，檢出率4.5％，t(9；22)(q34；q11)/BCR-ABL1檢出率為2.4％。通過隱匿性染色體重排的檢測，提高了核型異常的檢出率。
　　 2、PHF6基因突變是T-ALL中一類再現性遺傳學異常，突變組患者中位無復發(fā)時間明顯短于未突變組：NOTCH1基因突變是T-ALL患者中最常見的突變；FBXW7、WT1基因突變發(fā)生率明顯低