白血病微環(huán)境中成骨細(xì)胞與白血病細(xì)胞相互作用研究.pdf

1、目的:成骨細(xì)胞是骨髓微環(huán)境的重要組分，白血病細(xì)胞與成骨細(xì)胞間的相互作用是白血病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，既包括成骨細(xì)胞對白血病細(xì)胞的作用，也包括白血病細(xì)胞對成骨細(xì)胞的重塑。本論文通過研究成骨細(xì)胞對白血病細(xì)胞存活、凋亡的影響，以及白血病細(xì)胞對成骨細(xì)胞作用，確定成骨細(xì)胞與白血病細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制，以闡明白血病微環(huán)境的異常機(jī)制及在白血病發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法:以來源于小鼠白血病模型的AML1-ETO9a-Rac1、MLL-AF9白血

2、病細(xì)胞以及來源于新生小鼠顱骨的成骨細(xì)胞系MC3T3-E1為研究對象，將白血病細(xì)胞與小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1體外共培養(yǎng)4天后，流式細(xì)胞技術(shù)檢測白血病細(xì)胞的GFP陽性比例，以此比較單獨(dú)培養(yǎng)的白血病細(xì)胞、與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)的白血病細(xì)胞的存活率;通過Annexin V及PI聯(lián)合標(biāo)記的流式細(xì)胞技術(shù)檢測白血病細(xì)胞的凋亡情況，Western-blot方法檢測白血病細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)信號分子的活化水平;另外，將AE9a-Rac1白血病發(fā)病小鼠、MLL-

3、AF9白血病發(fā)病小鼠體內(nèi)的成骨細(xì)胞消化分離，提取細(xì)胞的總RNA，并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用實(shí)時定量RT-PCR方法檢測成骨細(xì)胞內(nèi)的成骨微環(huán)境相關(guān)的因子TPO、N-cadherin、OPN、Ang1的轉(zhuǎn)錄水平是否存在異常;通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測并驗(yàn)證急性髓系白血病患者骨髓血漿中的TPO的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:與成骨細(xì)胞MC3T3-E1共培養(yǎng)的AML1-ETO9a-Rac1白血病細(xì)胞的GFP陽性比例明顯高于體外單獨(dú)培養(yǎng)的AML1-ET

4、O9a-Rac1白血病細(xì)胞。體外單獨(dú)培養(yǎng)4天的AML1-ETO9a-Rac1白血病細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡，細(xì)胞凋亡比例達(dá)到79％(±2.3％)，而與成骨細(xì)胞MC3T3-E1共培養(yǎng)的AML1-ETO9a-Rac1白血病細(xì)胞則能很好的存活，凋亡比例僅為20％(±1.9％)。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示與成骨細(xì)胞MC3T3-E1共培養(yǎng)的AML1-ETO9a-Rac1白血病細(xì)胞的凋亡凋亡相關(guān)信號分子的活化水平比較單獨(dú)培養(yǎng)的細(xì)胞明顯偏低。在MLL-AF9白血

5、病細(xì)胞與成骨細(xì)胞MC3T3-E1共培養(yǎng)體系中，得到類似于AML1-ETO9a-Rac1白血病細(xì)胞的存活，凋亡結(jié)果。另外，將消化分離獲得的原代成骨細(xì)胞與白血病細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，也得到了同樣的結(jié)果。通過RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)，白血病發(fā)病小鼠的原代成骨細(xì)胞的N-cadherin轉(zhuǎn)錄水平略微升高，AE9a-Rac1白血病發(fā)病小鼠的原代成骨細(xì)胞的Ang1轉(zhuǎn)錄水平明顯減少，另外，TPO的轉(zhuǎn)錄水平較正常小鼠的偏高。MLL-AF9白血病發(fā)病小鼠的原代成骨細(xì)

6、胞的TPO的轉(zhuǎn)錄水平同樣偏高。最后，選取TPO作為骨髓微環(huán)境重要因子，檢測其在白血病患者骨髓中的水平。AML FAB各亞型患者骨髓血漿中TPO表達(dá)水平比較于正常供者的骨髓血漿，均有不同程度的升高，其中M3、M5兩個亞型的TPO含量升高最為明顯。另外，存在AML1-ETO、MLL-AF9融合突變的AML患者的骨髓血漿TPO表達(dá)水平均比正常供者的高。
　　結(jié)論:成骨細(xì)胞能夠支持自血病細(xì)胞的存活，抑制白血病細(xì)胞的凋亡。同時，白血病細(xì)胞也