不同血型臍血清在干細(xì)胞體外擴(kuò)增中的應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　 干細(xì)胞,如胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)、造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSCs)或間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)等,具有自我更新和無(wú)限增殖的能力,并能在特定因素的影響或誘導(dǎo)下向血、心肌、骨、神經(jīng)、肝細(xì)胞等多譜系分化。因此,干細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用非常廣泛。但是,輸注給病人的細(xì)胞數(shù)量只有達(dá)到7×107/kg時(shí)才能發(fā)

2、揮有效的治療作用,相對(duì)于成人,單份采集的干細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足以達(dá)到臨床治療效果,故體外大規(guī)模有效擴(kuò)增是干細(xì)胞應(yīng)用于臨床細(xì)胞治療及組織工程學(xué)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。迄今為止,胎牛血清(fetal bovine serum,FBS或fetal calf serum,FCS)因其含有較多的生長(zhǎng)刺激因子和較少的生長(zhǎng)抑制因子,仍是干細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用最為廣泛的生長(zhǎng)添加劑。但作為異種蛋白質(zhì),它本身有攜帶細(xì)菌、病毒、蛋白傳染性疾病或朊病毒的風(fēng)險(xiǎn)。另外,應(yīng)用FBS/FC

3、S培養(yǎng)后的干細(xì)胞內(nèi)含有牛血清蛋白(7mg～30mg/108cells),可以使受者體內(nèi)產(chǎn)生抗牛蛋白抗體引起免疫反應(yīng),從而導(dǎo)致患者尤其在重復(fù)輸注干細(xì)胞治療后治療失效。因此FBS在干細(xì)胞臨床大規(guī)模培養(yǎng)中的不利因素已經(jīng)逐漸暴露出來(lái),現(xiàn)已有很多學(xué)者研究FBS/FCS的替代品,其中較多的就是應(yīng)用人血清或血清衍生物來(lái)替代。包括成人血清、血小板衍生物(血小板裂解液、凝血酶激活血小板釋放因子)、臍血清等。臍血清是一種富含干細(xì)胞生長(zhǎng)存活所需的不同的細(xì)胞因

4、子的資源,對(duì)干細(xì)胞擴(kuò)增更有刺激效應(yīng)并維持細(xì)胞的未成熟狀態(tài)。同時(shí)臍血清作為醫(yī)療廢棄物,取自產(chǎn)婦分娩后,避免了胚胎等的倫理道德問(wèn)題,故臍血清獲得相對(duì)更容易且更廣泛,且作為胎兒與母體的聯(lián)接紐帶,其免疫原性更低。因此本實(shí)驗(yàn)選擇臍血清作為主要研究對(duì)象,對(duì)比其與胎牛血清的作用效果以及不同血型間的影響,為CBS在干細(xì)胞體外擴(kuò)增中的應(yīng)用,特別是臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)中所采用的細(xì)胞-人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞(human placenta-derivedm

5、esenchymal stem cells,hPDMSCs)來(lái)源于正常足月分娩的胎盤(pán),它具有和臍血相同的來(lái)源容易、廣泛、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn),所提取的間充質(zhì)干細(xì)胞同骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有相同的特性:自我更新和無(wú)限增殖的能力且能向多譜系分化等。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)、檢測(cè)擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量及所用時(shí)間、細(xì)胞周期以及培養(yǎng)前后細(xì)胞的表型、分化能力等方面的變化,對(duì)比胎牛血清與臍血清對(duì)人胎盤(pán)問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增的影響的同時(shí),進(jìn)一步探討了不同血型臍血清對(duì)不同血型同種異

6、體人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增的影響。
　　 方法：
　　 1、分離培養(yǎng)hPDMSCS:取足月剖宮產(chǎn)胎兒胎盤(pán)子體面組織,PBS沖洗,剔除血管、神經(jīng),采用組織微塊貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)hPDMSCs。
　　 2、臍血清(CBS)的提取:無(wú)菌條件下無(wú)抗凝取健康產(chǎn)婦足月臍血,靜置、離心、過(guò)濾,無(wú)菌檢測(cè)后分裝備用。
　　 3、細(xì)胞培養(yǎng)與擴(kuò)增:方案一:同密度(6000個(gè)細(xì)胞/cm2)接種,每代均培養(yǎng)相同的天數(shù)(3d～4d),

7、作MTT檢測(cè),再同原始接種濃度的細(xì)胞吸光度進(jìn)行比較得出增殖比率來(lái)繪制各代增殖曲線。方案二:初始以6000個(gè)細(xì)胞/cm2密度接種后各代均1:2傳代,至細(xì)胞14d生長(zhǎng)不足50％傳代終止。分別計(jì)算累積群體倍增數(shù)(cumulative population doublings,CPD)和細(xì)胞傳代時(shí)間(generation time)即細(xì)胞倍增的平均時(shí)間,檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
　　 4、細(xì)胞周期檢測(cè):取P2、P10細(xì)胞,流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)

8、胞周期。
　　 5、細(xì)胞表面標(biāo)記物與細(xì)胞分化能力檢測(cè):取培養(yǎng)前、后的hPDMSCs,流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD31、CD45、CD73、CD105、CD166的表達(dá)情況及誘導(dǎo)hPDMSCs向軟骨、內(nèi)皮方向分化。
　　 結(jié)果：
　　 1、胎盤(pán)中提取的hPDMSCs形態(tài):呈梭形或成纖維狀,可持續(xù)傳代生長(zhǎng)。
　　 2、人胎盤(pán)組織來(lái)源的細(xì)胞表面標(biāo)記特征:CD105、CD166,不表達(dá)CD31、CD34、CD45。

9、　　 3、hPDMSCs的擴(kuò)增情況:
　　 (1)hPDMSCs形態(tài):CBS培養(yǎng)后細(xì)胞較小、更像兩端尖的紡錘形,同時(shí)細(xì)胞呈篩網(wǎng)狀生長(zhǎng)。CBS較FBS維持的較小形態(tài)代數(shù)更長(zhǎng)。不同血型CBS間細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差別。
　　 (2)培養(yǎng)后hPDMSCs增殖情況:取培養(yǎng)較典型的不同的MTT值繪制曲線,TBD組細(xì)胞傳代數(shù)最少、峰值最低,以色列組次之,CBS組傳代數(shù)最多、峰值最高。
　　 (3)培養(yǎng)傳代代數(shù)和增殖后細(xì)胞數(shù)量:C

10、BS組細(xì)胞代數(shù)最長(zhǎng),ISA-FBS組次之,TBD-FBS組增殖代數(shù)最短,CBS組CPD均明顯高于ISA-FBS和TBD-FBS組。CBS組與FBS組差別有顯著意義(p<0.05),不同血型CBS組間差別無(wú)顯著意義(p>0.05)。
　　 (4)細(xì)胞周期流式分析:流式分析表明各組培養(yǎng)的細(xì)胞大部分處于G0/G1期,說(shuō)明細(xì)胞有較強(qiáng)的增殖能力,P2代細(xì)胞分析無(wú)明顯差異,P10代時(shí)CBS組處于G0/G1期更多,ISA-FBS組次之,TBD

11、-FBS最低,FBS組與CBS組相比差別均有顯著意義(p<0.05。
　　 4、hPDMSCs表面標(biāo)記特征及分化能力的變化:流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記在CBS培養(yǎng)前后無(wú)明顯改變。用CBS培養(yǎng)增殖后的細(xì)胞均可向軟骨、內(nèi)皮方向分化。
　　 結(jié)論：
　　 1、臍血清與胎牛血清相比,在hPDMSCs的體外擴(kuò)增中,具有更強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞增殖能力。
　　 2、不同血型臍血清對(duì)不同血型來(lái)源的hPDMSCs體外擴(kuò)增作用無(wú)顯著