小鼠骨髓衍生肝干細(xì)胞體外擴(kuò)增及體內(nèi)分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目前治療肝功能衰竭最常用的方法是肝移植，但由于供體匱乏、免疫排斥和高額費(fèi)用等問題，肝移植的運(yùn)用受到了一定的限制。骨髓細(xì)胞可以分化形成肝細(xì)胞的特定干細(xì)胞群，被稱之為骨髓衍生肝干細(xì)胞(bonemarrowderivedliverstemcellsBMDLSC)，為肝臟疾病治療提供了新思路和新手段。雖然BMDLSC的存在已被眾多學(xué)者公認(rèn)，但具體細(xì)胞表型還存在爭(zhēng)議。Lagasse[1]在酪氨酸小鼠研究中發(fā)現(xiàn)c-kit+Sea+Lin-細(xì)胞向肝細(xì)

2、胞分化的能力比較強(qiáng)，而后唐等[2]在放射性小鼠肝損傷修復(fù)的研究中更是進(jìn)一步指出c-kit+Lin-(CD117)是一群富含BMDLSC的骨髓干細(xì)胞群。與其它類型的骨髓干細(xì)胞類似，c-kit+Lin-細(xì)胞的數(shù)量有限，難以滿足未來(lái)應(yīng)用的需要。 本實(shí)驗(yàn)利用免疫活性細(xì)胞磁珠分選法(MagneticactivatedcellseparationMACS)對(duì)雄性小鼠骨髓c-kit+Lin-細(xì)胞進(jìn)行分選提純[3]。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，參照臍血造血干

3、細(xì)胞、骨髓造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)，我們選用SCF+HGF+FL+LIF+TPO因子組合中添加不同濃度的IL-3，在STEMPRO-34SFM無(wú)血清培養(yǎng)基中對(duì)其進(jìn)行體外擴(kuò)增，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)c-kit+Lin-細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞凋亡率，得出IL-3最佳濃度。將剛分選及擴(kuò)增后c-kit+Lin-細(xì)胞移植入酒精性肝纖維化雌性模型小鼠體內(nèi)，檢測(cè)移植前后酒精性肝纖維化模型雌性小鼠的肝功能，利用原位雜交的方法檢測(cè)雌性小鼠肝臟中存在Y染色體性別決定基因cD

4、NA(SRY)陽(yáng)性和白蛋白mRNA陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量，比較兩組小鼠的肝臟形態(tài)、肝功能變化和移植細(xì)胞的分布、分化及歸巢情況。為將來(lái)臨床上進(jìn)行骨髓衍生肝干細(xì)胞肝內(nèi)移植治療肝疾病的研究奠定基礎(chǔ)。 材料和方法： 1.小鼠骨髓干細(xì)胞c-kit+Lin-分離和檢測(cè) 1.1免疫活性細(xì)胞磁珠分選法(MagneticactivatedcellseparationMACS)分選BMDLSC。 取6～8周SPF級(jí)BALB/c雄性小

5、鼠，無(wú)菌條件下收集其骨髓細(xì)胞，采用MACS方法分離c-kit+Lin-細(xì)胞。 1.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞純度。 先用PE標(biāo)記細(xì)胞群，將分離前細(xì)胞群和分離后細(xì)胞群進(jìn)行比較，可檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記在分選前后的純度情況及一抗和抗體磁珠結(jié)合情況。 2.小鼠骨髓干細(xì)胞c-kit+Lin-的體外擴(kuò)增 2.1細(xì)胞因子及實(shí)驗(yàn) 分組在SCF+HGF+FL+LIF+TPO因子組合中(SCF、LIF、FL和TPO終濃度為50ng

6、/ml，HGF終濃度為10ng/ml)添加不同濃度的IL-3分為： A：SCF+HGF+FL+LIF+TPO(0ng/ml)； B：SCF+HGF+FL+LIF+TPO+IL-3(10ng/ml)； C：SCF+HGF+FL+LIF+TPO+IL-3(20ng/ml)； D：SCF+HGF+FL+LIF+TPO+IL-3(40ng/ml). 2.2c-kit+Lin-細(xì)胞短期培養(yǎng) 培養(yǎng)體系

7、為STEMPRO-34SFM無(wú)血清培養(yǎng)基。c-kit+Lin-細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml，復(fù)種3孔，在37℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)7天。培養(yǎng)第3天半量換液，第7天檢測(cè)總細(xì)胞數(shù)(TotalCells)，c-kit+Lin-細(xì)胞數(shù)，根據(jù)公式：擴(kuò)增倍數(shù)=擴(kuò)增前細(xì)胞總數(shù)/擴(kuò)增后細(xì)胞總數(shù)，換算出擴(kuò)增倍數(shù)。及檢測(cè)細(xì)胞凋亡率等指標(biāo)。 2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)c-kit+Lin-細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞凋亡率 用PE標(biāo)記細(xì)胞群，流式

8、細(xì)胞儀檢測(cè)c-kit+Lin-細(xì)胞數(shù)目及百分率。細(xì)胞凋亡的膜聯(lián)蛋白V(annexin-V)用annexin-V-FITC和2μl碘化丙錠PI(50μg/ml)標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)標(biāo)記細(xì)胞數(shù)目及百分率。 3.同種同品系肝內(nèi)移植干細(xì)胞群 3.1分組 酒精性肝損傷模型雌性小鼠32只，隨機(jī)分為4組，分別給予移植擴(kuò)增后的c-kit+Lin-細(xì)胞、新鮮分選的c-kit+Lin-細(xì)胞、對(duì)照組(僅予以注射Buffer2)及空白對(duì)

9、照組(直接取血及肝)；另外正常雌性小鼠8只(直接取血及肝)。 3.2肝內(nèi)移植 移植前，將擴(kuò)增后的c-kit+Lin-細(xì)胞、新鮮分選的c-kit+Lin-細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，離心8℃條件，10min，×1500rmp。棄上清，加入Buffer22.5ml重懸細(xì)胞。調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度1×106個(gè)/ml，移植組每只予100μ1細(xì)胞懸液尾靜脈注射。對(duì)照組僅予以注射Buffer2(PBS，PH7.2+0.5％BSA+2mMEDTA)100μl

10、。 3.3移植后肝功能檢查 分別于移植30天后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組活殺小鼠取血清，測(cè)量血清中ALT、AST和ALB等肝功能指標(biāo)。 3.4肝組織常規(guī)病理檢查 解剖小鼠完整取出肝臟組織，石蠟包埋，按標(biāo)準(zhǔn)操作行HE、VG染色，光鏡下觀察結(jié)果。 3.5原位雜交檢查 切片防脫RNA處理。設(shè)計(jì)制備并運(yùn)用小鼠Y染色體性別決定基因cDNA(SRY)探針以及白蛋白mRNA探針，按原位雜交方法操作，熒光顯微鏡下觀察

11、結(jié)果。 方法同上，在同一切片上先行白蛋白mRNA原位雜交，雜交后滴加Y染色體SRY基因DNA探針。在熒光顯微鏡下激發(fā)各自波長(zhǎng)，分別照相，并進(jìn)行圖象融合，觀察干細(xì)胞移植分化情況及功能表達(dá)。 3.6移植干細(xì)胞肝內(nèi)增殖情況 比較每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野(油鏡)，每個(gè)視野細(xì)胞數(shù)約20個(gè)，記錄雙陽(yáng)性細(xì)胞率。每組取6張切片計(jì)數(shù)，了解移植細(xì)胞肝內(nèi)轉(zhuǎn)化情況。 4.統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)用X±S表示。應(yīng)用SPSS11

12、.5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)采用單向量方差(One-wayANOVA)和兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independend-SamplesTTest)分析。P≤0.05表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.MACS分離c-Kit+lin-細(xì)胞純度均達(dá)到84％，回收率達(dá)到80％以上。 2.在本實(shí)驗(yàn)條件下，IL-3能促使細(xì)胞總數(shù)和c-kit+Lin-細(xì)胞增殖，擴(kuò)增倍數(shù)分別為40.29～245.41倍及7.32～15.80

13、倍，并且在一定范圍內(nèi)的濃度具有劑量依賴性，但是超過一定濃度(20ng/ml)的IL-3，再增加劑量對(duì)干細(xì)胞作用不明顯。IL-3還能有效抑制細(xì)胞調(diào)亡，隨著IL-3濃度的上升，而調(diào)亡減少，無(wú)IL-3組調(diào)亡率為18.43％，而40ng/ml組調(diào)亡率僅為4-66％。 3.移植擴(kuò)增后的c-kit+Lin-細(xì)胞組和移植新鮮分選的c-kit+Lin-細(xì)胞組，在移植30天后的肝功能均有明顯恢復(fù)，指標(biāo)接近正常，兩組比較沒有顯著差異；對(duì)照組無(wú)明顯變

14、化。 4.兩移植組在移植30天后，HE及VG染色病理切片發(fā)現(xiàn)移植組肝組織少許肝纖維化，對(duì)照組肝臟纖維化較明顯。Y染色體SRY基因DNA探針以及白蛋白mRNA雙重原位雜交結(jié)果表明：兩移植組可見移植細(xì)胞在肝內(nèi)定居并轉(zhuǎn)化成有功能的肝細(xì)胞。計(jì)數(shù)細(xì)胞比例，兩組無(wú)顯著差異。 結(jié)論： 1.MACS細(xì)胞分選系統(tǒng)能有效分選c-kit+Lin-細(xì)胞，純度和回收率均較高。 2.在本實(shí)驗(yàn)條件下，IL-3能促使c-kit+Lin-

15、細(xì)胞增殖，并且在一定范圍內(nèi)的濃度具有劑量依賴性，最佳濃度為20ng/ml，再增加劑量對(duì)干細(xì)胞作用不明顯。IL-3還能有效抑制細(xì)胞調(diào)亡。 3.移植擴(kuò)增后的c-kit+Lin-細(xì)胞組、移植新鮮分選的c-kit+Lin-細(xì)胞組，均能明顯改善肝損傷小鼠的肝功能；在受體小鼠肝臟可檢測(cè)到移植細(xì)胞在肝內(nèi)定居并轉(zhuǎn)化成有功能新生肝細(xì)胞；兩移植組肝功能改善、新生肝細(xì)胞數(shù)量沒有顯著差異，說明在本實(shí)驗(yàn)條件下，擴(kuò)增對(duì)c-Kit+lin-細(xì)胞的歸巢、在體內(nèi)