表達IL-21的CIK細胞對肝癌的治療研究.pdf

1、肝癌是惡性程度極高，預后極差的惡性腫瘤。目前各種治療手段并不能從根本上改變肝癌患者的預后?；?病毒治療成為一種新的治療手段開始應用于肝癌的治療。白細胞介素在免疫應答和調節(jié)中起到重要的作用，其中IL-21主要由活化的CD4+T細胞分泌，能增強效應T細胞及活化的NK細胞的功能，從而有效增強機體的天然免疫以及特異性免疫反應，對肝癌具有良好的治療效果，本課題選擇刺激T細胞增殖、抗腫瘤的IL-21基因，并利用腺病毒載體攜帶該基因對肝癌進行治療，

2、同時利用T細胞作為細胞載體攜帶腺病毒逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，從而使腺病毒有效地到達腫瘤部位，提高靜脈注射后腺病毒到達腫瘤細胞的效率，以便更有效的治療肝癌。
　　 ITR是腺相關病毒(Adeno-associated Virus，AAV)基因組的末端重復序列，每個ITR長145bp。其中前125bp可形成一個T形的發(fā)夾結構，由兩個小回紋結構(palindrome)組成，旁邊為一個較大的回紋結構。ITR的序列可有兩種構型：flip(B回

3、紋接近3’端)或flop(C回紋接近3’端)。一個特定分子AAV的兩個末端形成flip或flop的機率都相等。單鏈形式的AAVITR容易形成的T型發(fā)夾結構，還可能形成另外的構型。ITR序列是AAV病毒的復制、整合、拯救和包裝所必需的順式作用元件。本實驗選擇構建的腺病毒為非增殖型腺病毒，其在宿主細胞內存在的數量完全由剛開始進入細胞的病毒滴度決定，為了使其在宿主內的數量擴增，本課題在腺病毒載體的末端加入了ITR結構，即包裝出來的腺病毒包含A

4、AV的ITR結構。因此命名病毒為Ad5/AAV、Ad5F35/AAV。腺病毒能夠高效感染多種細胞，其基因組可插入較大的外源日的基因片段，并能夠快速啟動目的基因表達，但其基因組不能夠復制而影響了目的基因的表達，而腺相關病毒的基因組可因其末端反向重復序列ITR的存在發(fā)生復制，使目標基因在靶細胞中長期表達。
　　 本實驗主要有以下三部分組成：
　　 一、表達hIL-21的腺病毒載體的構建和制備
　　 使用PCR方法將h

5、IL-21基因從pDCC318-hIL-21模板中擴增出來，然后使用限制性內切酶SαlI、BamHI酶切hIL-21和pDC759，然后將處理后的片段連接到載體片段上，即得到質粒載體pDC759-hIL-21。將質粒載體pDC759-hIL-21與腺病毒骨架載體pAd5、pAd5F35共轉染293細胞，10天后出現病毒空斑，經過3次病毒空斑純化，提取病毒基因組進行PCR鑒定，鑒定正確的腺病毒命名為Ad5/AAV-hIL-21、Ad5F3

6、5/AAV-hIL-21。經293細胞擴增、氯化銫密度梯度離心純化、TCID50測得病毒Ad5/AAV-hIL-21、Ad5F35/AAV-hIL-21滴度分別為8.95×109pfu/ml、2.65×1010pfu/ml。同時本實驗也構造了攜帶含有CopGFP的5型以及35型腺病毒分別命名為Ad5/AAV-CopGFP、Ad5F35/AAV-CopGFP，二者的滴度分別為5.15×109pfu/ml、7.1×109pfu/ml。

7、>　　 二、CIK細胞的培養(yǎng)以及體外表達實驗
　　 這部分的研究主要是基于構建好的病毒其在體外條件下，基因組表達框的表達能力的一個鑒定以及在體外條件下5型腺病毒與35型腺病毒對CIK細胞感染能力的對比；探索不同MOI情況下最大感染能力的優(yōu)化和選擇，以便推論出最優(yōu)的感染條件。為了得到這個結果，本實驗做了如下實驗研究：
　　 首先，本實驗選用Ad5/AAV-CopGFP、Ad5F35/AAV-CopGFP以不同MOI感染C

8、IK細胞，其MOI的控制梯度分別為1，5，10,50,100,1000。感染48、96小時后分別在熒光顯微鏡下觀察其各種條件下的熒光強度，本實驗證明了Ad5F35/AAV-CopGFP對CIK細胞的感染能力遠遠強于Ad5/AAV-CopGFP對CIK細胞的感染能力。并且，隨著MOI的增加Ad5F35/AAV-CopGFP對CIK細胞的感染能力逐漸增強，但是在MOI增加到1000的時候Ad5F35/AAV-CopGFP對CIK細胞的感染能

9、力會有所下降，原因是因為在該MOI的條件下，Ad5F35/AAV-CopGFP對CIK細胞有一定的殺傷作用，所以在MOI為50的條件下Ad5F35/AAV-CopGFP對CIK細胞的感染能力是較為合適的，本實驗選擇該條件為下面實驗的一個參照比值。
　　 其次，本實驗用Ad5/AAV-hIL-21、Ad5F35/AAV-hIL-21對SMMC-7721細胞株進行感染，MOI的梯度設置為0,1，5，10,20。在病毒感染細胞48hr

10、后收取上清進行檢測，使用ELISA試劑盒檢測hIL-21的表達量，同時使用Ad5F35/AAV-hIL-21對CIK細胞進行感染，MOI的梯度設置為0,1，5，10,50,100,使用ELISA試劑盒檢測hIL-21的表達量。檢測的結果顯示Ad5/AAV-hIL-21、Ad5F35/AAV-hIL-21對SMMC-7721細胞株的感染能力相似，并且表達情況也差的不是很大，在MOI為20的情況下hIL-21的表達量較高。
　　 再

11、次，本實驗對CIK細胞的生長進行一個比較系統(tǒng)的研究，并且繪制了22天CIK細胞的生長曲線，本實驗研究發(fā)現，隨著轉袋后培養(yǎng)，第六天以后，調節(jié)好CIK的密度為一個較高的水平，在以后的時間CIK的生長呈現倍增的生長趨勢。在培養(yǎng)第20天以后CIK的數量基本上維持不變，其生長狀態(tài)開始出現停滯，在以后的時間里CIK的生長出現衰退的狀況，因此，在CIK細胞培養(yǎng)到12天以后開始作為荷瘤小鼠治療的時間。
　　 三、表達hIL-21的CIK細胞體內

12、治療肝癌的體內實驗研究
　　 本實驗皮下注射5×106個/只SMMC-7721細胞用于建立裸鼠肝癌模型。
　　 1、CIK細胞基因治療系統(tǒng)對裸鼠移植瘤的抑制作用，CIK/Ad5F35/AAV-hIL-21治療組療效明顯優(yōu)于PBS對照組，具有明顯的統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 2、CIK細胞基因治療系統(tǒng)對荷瘤裸鼠生存期的影響。PBS對照組在治療開始后第27天開始出現死亡，幾天內全部死亡。直至對照組小鼠全部死亡

13、時，CIK/Ad5F35/AAV-hIL-21治療組小鼠全部存活。
　　 基于體外實驗的一個研究結果，本實驗選用裸鼠作為荷瘤小鼠的實驗動物，并且本實驗選擇SMMC-7721細胞作為荷瘤小鼠造模的細胞，在每個小鼠的皮下注射5×106個細胞。在裸鼠成瘤以后，進行治療，治療的分組在下面的實驗研究中會進行詳細的介紹。治療的療效主要分為，效果指標和生存指標，本實驗的研究結果顯示當Ad5F35/AAV-hIL-21感染CIK細胞后尾靜脈回輸

14、到荷瘤小鼠體內之后，腫瘤的治療效果較為顯著。
　　 結論：本課題成功構建了同時攜帶HIL-21基因的嵌合型腺病毒Ad5F35/AAV-hIL-21，并且該病毒高效感染CIK細胞，且高表達hIL-21.。CIK/Ad5F35/AAV-hIL-21治療系統(tǒng)能顯著抑制裸鼠移植瘤和延長裸鼠生存期。該方案綜合了腫瘤細胞治療和基因-病毒治療的雙重優(yōu)勢，克服了基因-病毒治療系統(tǒng)體內運輸病毒效率低的缺陷，也彌補了單純腫瘤細胞治療效果差的不足，對