sPD-1協(xié)同IL-21抗小鼠肝細(xì)胞癌免疫的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探索sPD-1對IL-21抗肝細(xì)胞癌免疫功能的影響，并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。
　　 方法：
　　 1．重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定分離BALB/c小鼠脾細(xì)胞，ConA刺激后用RT-PCR方法擴(kuò)增sPD-1cDNA及IL-21cDNA，克隆入真核細(xì)胞高效表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1中，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-sPD-1和pcDNA3.1-mIL-21。用脂質(zhì)體2000將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，用EL

2、ISA試劑盒檢測sPD-1及IL-21的表達(dá)；大量擴(kuò)增sPD-1及IL-21的真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　 2．小鼠肝細(xì)胞癌模型的建立在BALB/c小鼠（雄性6～8周齡）的右后肢皮下接種100μL濃度為1×106個(gè)/mlH22細(xì)胞，成功構(gòu)建小鼠的肝細(xì)胞癌模型。
　　 3．分組及干預(yù)措施隨即分為5組（每組8只），1）聯(lián)合組；2)sPD-1組；3)IL-21組；4)pcDNA3.1組；5）生理鹽水組。接種瘤細(xì)胞（對照組注入生理鹽水）

3、后第二天于注射部位瘤內(nèi)注射重組質(zhì)粒（對照組注入生理鹽水），每間隔兩天注射一次，共注射八次，質(zhì)粒DNA濃度1ug/μL，注射量100μL/只(聯(lián)合組每種重組質(zhì)粒各50μL)。
　　 4．指標(biāo)檢測：(1)自注射日起，每隔三天測量各組小鼠腫瘤的長、短徑，計(jì)算注射后7d、14d、21d及28d時(shí)腫瘤體積。(2)于注射結(jié)束后，處死各組小鼠，取腫瘤組織，石蠟包埋并切片，蘇木素-伊紅(hematoxylin-esosin，HE)染色后光學(xué)顯微

4、鏡觀察；(3)免疫組織化學(xué)染色法檢測腫瘤組織PD-L1的表達(dá)情況。(4)ELISA法檢測各組小鼠血清中IL-2、IFN-γ及IL-10的量。(5)流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytoMeter，F(xiàn)CM)檢測各組小鼠脾細(xì)胞中CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）的數(shù)量。(6)分離各組小鼠的脾細(xì)胞，RT-PCR法從mRNA水平檢測脾細(xì)胞中IL-2、IL-10及IFN-γ的表達(dá)量。
　　 結(jié)果：
　　 1.PCR、酶切

5、、測序鑒定表明重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IL-21及pcDNA3.1-sPD-1構(gòu)建成功。
　　 2．成功制備小鼠H22肝癌腹水瘤細(xì)胞，從腫瘤的生長情況及瘤細(xì)胞的HE染色證實(shí)了小鼠H22肝癌移植瘤模型的成功構(gòu)建。
　　 3．免疫組化法證實(shí)了H22肝癌細(xì)胞高表達(dá)PD-L1分子。
　　 4．腫瘤生長曲線顯示sPD-1與IL-21聯(lián)合應(yīng)用能明顯抑制腫瘤生長，與IL-21或sPD-1單獨(dú)應(yīng)用相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

6、P＜0.05)。
　　 5.RT-PCR法及ELISA法顯示聯(lián)合組中IL-2及IFN-γ表達(dá)水平明顯高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，相反聯(lián)合組中IL-10的表達(dá)水平最低，與其它組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜o(jì)．05)。
　　 6．流式細(xì)胞術(shù)檢測脾細(xì)胞中免疫細(xì)胞的變化，聯(lián)合治療組中CD8+T細(xì)胞及NK細(xì)胞的比例明顯升高，與IL-21或sPD-1單獨(dú)應(yīng)用相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。抑制免疫反應(yīng)的Tre