2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、上皮性卵巢癌一直是婦科惡性腫瘤中致死率最高的一類腫瘤,被認為是一個“沉默殺手”。它起病隱匿、進展迅速,70%以上的患者在診斷時已處于晚期,腫瘤已發(fā)生廣泛盆腹腔或遠處轉(zhuǎn)移,5年生存率僅有30%。所以,尋找早期診斷及早期治療方法,一直是婦科臨床醫(yī)生與婦科腫瘤基礎(chǔ)研究者多年來的工作重點。當前,上皮性卵巢癌的治療為手術(shù)治療輔助以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療,但是,現(xiàn)有的治療方法未能取得滿意效果,由于化療耐藥而導(dǎo)致的卵巢癌治療失敗成為難以克服的問題。因此

2、,尋找卵巢癌治療新途徑十分必要。
  近期,越來越多的學(xué)者把目光投向基因治療,作為一種新興的治療方法,基因治療為上皮性卵巢癌患者帶來了希望。隨著人類對上皮性卵巢癌增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機制研究的不斷深入,上皮性卵巢癌的基因治療和細胞移植免疫治療已成為該領(lǐng)域新的研究熱點。目前已有越來越多的學(xué)者嘗試采用不同的研究方法,應(yīng)用不同的研究途徑對腫瘤的靶向性治療進行廣泛深入的研究與探索,一些研究已在動物實驗中取得了相當大的進展,甚至一些腫瘤的基因

3、治療和細胞移植免疫治療策略已經(jīng)進入臨床應(yīng)用階段。但基因治療和細胞移植免疫治療方法作為腫瘤治療的新手段仍有待于進一步成熟,需要進一步深入的研究與探索。
  間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是近期研究發(fā)現(xiàn)的一種具有自我更新和多向分化潛能的原始細胞。目前很多研究發(fā)現(xiàn),MSCs具有腫瘤組織趨向性,可以作為腫瘤靶向治療的載體細胞。研究發(fā)現(xiàn),人臍帶間充質(zhì)干細胞(Human umbilical cord m

4、esenchymal stem cells,hUCMSCs)不會促進實體腫瘤的生長和浸潤,在腫瘤治療中更為安全。hUCMSCs不僅可作為腫瘤靶向治療的載體,還可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號途徑發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖的作用。
  白細胞介素21(interleukin-21,IL-21)是具有多種生物學(xué)功能的重要免疫調(diào)節(jié)因子,能介導(dǎo)固有性免疫向適應(yīng)性免疫轉(zhuǎn)換,參與體液免疫和細胞免疫應(yīng)答。IL-21能夠促進臍血祖細胞轉(zhuǎn)化為NK

5、細胞,促進B、T細胞增殖,并使其對靶細胞的細胞毒性增加。越來越多的研究已經(jīng)證實IL-21細胞因子在抗腫瘤治療中具備強大的免疫調(diào)節(jié)潛能。細胞基因修飾在基因治療中一直為人們所關(guān)注,并將逐步成為治療多種疾病的一種重要手段。因此,將IL-21構(gòu)建于含有增強綠色熒光蛋白的慢病毒載體pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen上,將重組慢病毒體pHAGE-IL-21用于基因修飾的治療性實驗中,并對其效應(yīng)機制進行了初探。
  microRNA(

6、miRNA)是近期發(fā)現(xiàn)的一類非編碼小分子RNA,通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。miR-200家族(miR-141、miR-429、miR-200a、miR-200b、miR-200c)是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNA,系列研究發(fā)現(xiàn)它們能夠通過調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)影響腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力。研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌中存在miR-200c表達異常,miR-200c表達下調(diào)可能

7、與卵巢癌進展相關(guān),并且可能是卵巢癌的不良預(yù)后因素之一。
  目前,卵巢癌的基因治療仍大部分停留在動物實驗階段,在進入臨床應(yīng)用前尚有諸多需要解決的問題,譬如:如何選擇更有效的目的基因;如何使得帶有治療作用的重組載體高效率地轉(zhuǎn)移,并長期穩(wěn)定地高表達基因產(chǎn)物;怎樣有效地將基因治療與其它治療方法聯(lián)合應(yīng)用等?;趯σ陨蠁栴}的考慮,設(shè)計了本研究課題,即采用慢病毒攜帶IL-21基因轉(zhuǎn)導(dǎo)hUCMSCs,并聯(lián)合miR-200c共同發(fā)揮抗卵巢癌作用。

8、
  1.目的:
  本研究旨在將基因治療和細胞移植治療相結(jié)合,采用慢病毒攜帶IL-21基因轉(zhuǎn)染hUCMSCs,通過hUCMSCs將具有抗腫瘤效應(yīng)的IL-21細胞因子攜帶到腫瘤部位,使hUCMSCs、IL-21與miR-200c三者聯(lián)合共同發(fā)揮抗卵巢癌的作用,并探討和分析其可能的作用機制,以期為臨床使用miR-200c聯(lián)合hUCMSCs-IL-21基因治療卵巢癌提供實驗依據(jù)。
  2.方法:
  2.1 構(gòu)建含I

9、L-21基因的重組質(zhì)粒pHAGE-IL-21,并對其進行鑒定。隨后以重組質(zhì)粒包裝慢病毒,并對其進行鑒定,為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。
  2.2 原代培養(yǎng)hUCMSCs,并通過表面分子標記及成骨、成脂實驗鑒定hUCMSCs特性。
  2.3 重組慢病毒pHAGE-I L-21轉(zhuǎn)導(dǎo)hUCMSCs,檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)后的hUCMSCs中IL-21的表達及活性。
  2.4 體外實驗:1)miR-200c mimic轉(zhuǎn)染SKOV3并鑒定;2)

10、細胞隔離共培養(yǎng):將需要共培養(yǎng)的細胞分別接種于“Trans-well”體系中,分七組進行實驗:培養(yǎng)液對照組、hUCMSCs組、未插入IL-21基因片段的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)hUCMSCs(hUCMSCs-LV-Vec)組、插入IL-21基因片段的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)hUCMSCs(hUCMSCs-LV-IL-21)組、miR-200c組、hUCMSCs-LV-IL-21聯(lián)合miR-200c組和順鉑(DDP)組;3)MTT法測定各組上室內(nèi)細胞增殖情況;4)劃痕

11、試驗檢測細胞遷移能力;5)Transwell小室基質(zhì)膠侵襲試驗檢測細胞侵襲力。
  2.5 建立人卵巢癌細胞株SKOV3裸鼠移植瘤模型,成瘤后將荷瘤裸鼠分七組進行后續(xù)治療實驗:生理鹽水對照組、hUCMSCs組、hUCMSCs-LV-Vec組、hUCMSCs-LV-IL-21組、miR-200c組、hUCMSCs-LV-IL-21聯(lián)合miR-200c組和順鉑組。經(jīng)治療后觀察移植瘤大小、腫瘤病理及裸鼠臟器情況;取裸鼠外周血檢測血常規(guī)及

12、肝腎功能,初步評價hUCMSCs、慢病毒、IL-21及miR-200c用于裸鼠移植瘤治療的安全性;取裸鼠外周血檢測IFN-γ、TNF-α及IL-21水平;實時定量PCR法檢測腫瘤組織中NKG2D、MICA表達情況;免疫組化及Western blotting法檢測腫瘤組織中β-catenin,cyclin-D1,E-鈣粘蛋白,ZEB1,Gli1和Gli2表達情況。
  3.結(jié)果:
  3.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒pHAGE-CMV-M

13、CS-IzsGreen-IL-2,經(jīng)酶切及測序鑒定,結(jié)果表明重組質(zhì)粒pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen-IL-21構(gòu)建成功,命名為pHAGE-IL-21。pHAGE-IL-21、psPAX2、pMD2.G三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,24h后在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光蛋白表達,48小時后可見多量綠色熒光蛋白表達。用收獲的慢病毒在24孔板內(nèi)感染293T細胞,感染48h后在熒光顯微鏡下能夠觀察到熒光,慢病毒的滴度為1.0

14、×108TU/ml,證實慢病毒包裝成功,重組IL-21慢病毒和空載體慢病毒分別命名為LV-IL-21和LV-Vec。
  3.2 成功分離培養(yǎng)hUCMSCs,原代培養(yǎng)至第三代的hUCNSCs經(jīng)FCM鑒定,CD34(-)、CD45(-)、CD29(+)、CD90(+),符合hUCMSCs的細胞表型。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21天時,茜素紅染色可見染成橘紅色的結(jié)節(jié)狀或顆粒狀物,呈陽性反應(yīng)。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)21天時,油紅染色提示細胞胞漿內(nèi)充滿紅色脂肪油

15、滴,呈陽性反應(yīng)。
  3.3 LV-IL-21及LV-Vec分別轉(zhuǎn)導(dǎo)傳代后狀態(tài)較好的hUCMSCs,嘌呤霉素篩選,分別得到轉(zhuǎn)導(dǎo)LV-IL-21的hUCMSCs(hUCMSCs-LV-IL-21)和轉(zhuǎn)導(dǎo)LV-Vec的hUCMSCs(hUCMSCs-LV-Vec)。經(jīng)脾細胞增殖實驗證實,hUCMSCs-LV-IL-21表達的IL-21具有生物學(xué)活性。
  4.結(jié)論:
  (1)從臍帶中可成功分離培養(yǎng)獲得hUCMSCs。攜帶

16、IL-21的慢病毒可有效感染hUCMSCs。
  (2)慢病毒-IL-21感染的hUCMSCs能誘導(dǎo)IFN-γ、TNF-α分泌增加,促使NK細胞數(shù)量和活性增加,從而發(fā)揮良好的抗裸鼠卵巢癌移植瘤作用。該結(jié)果為臨床使用hUCMSCs為載體的基因治療卵巢癌研究奠定了實驗基礎(chǔ)。
  (3)hUCMSCs-LV-IL-21聯(lián)合miR-200c在體內(nèi)外均有良好的抗卵巢癌作用,其機制可能為:1)IL-21激活NK細胞,上調(diào)腫瘤組織中MIC

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