肝細(xì)胞的無血清培養(yǎng)研究.pdf

1、急性肝功能衰竭(acuteliverfailureALF)是一種嚴(yán)重的臨床綜合征，病情危重，進(jìn)展迅速，預(yù)后兇險，病死率高。目前，唯一有效的治療是原位肝移植。然而，由于供體器官缺乏、圍手術(shù)期成本高和手術(shù)復(fù)雜、需長期使用免疫抑制劑等原因，病人往往在等待供體的過程中由于病情進(jìn)展而迅速死亡，極大地限制了肝移植手術(shù)的廣泛開展?；诖朔N前提下，生物人工肝支持系統(tǒng)逐步成為治療肝功能衰竭的另一重要手段。生物人工肝能清除患者體內(nèi)蓄積的各種有害物質(zhì)，補充必

2、需物質(zhì)，改善內(nèi)環(huán)境，暫時替代衰竭肝臟的部分功能，為肝臟再生創(chuàng)造條件，作為通向肝移植的橋梁，降低患者的病亡率，目前已成為僅次于肝移植手術(shù)治療肝功能衰竭的最佳治療手段。
　　 生物人工肝的核心為反應(yīng)器中的肝細(xì)胞，生物人工肝對肝功能衰竭患者的肝支持作用幾乎完全依賴于所用肝細(xì)胞的生物學(xué)功能。通常，肝細(xì)胞的生長有賴于血清的存在，在普通培養(yǎng)基中，如不加血清，絕大部分肝細(xì)胞不能增值。血清的主要作用在于提供細(xì)胞生長增殖所需的激素、生長因子、轉(zhuǎn)移

3、蛋白和其它營養(yǎng)物質(zhì)，維持細(xì)胞較好的生長狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞的生長與分裂增殖。然而在生物人工肝的治療過程中，由于反應(yīng)器中殘留血清的肝細(xì)胞與實驗動物或病人血液直接接觸，易引起過敏反應(yīng)，影響治療效果甚至導(dǎo)致實驗動物死亡。所以，清除生物人工肝中殘留的血清就顯得尤為重要，也是生物人工肝面臨的亟待解決的問題之一。
　　 同時經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清還存在著多種缺點:首先，具有批間差異、不同批次血清間的生物活性和因子的不一致，導(dǎo)致產(chǎn)品和實驗結(jié)

4、果的重現(xiàn)性差，需要大量驗證工作;其次，血清的來源不穩(wěn)定，成分不明確、有抑制生長的成分、不利于疫苗和單克隆抗體等目的產(chǎn)品的分離純化;最后，存在污染外源病毒和致病因子的風(fēng)險，容易被病毒和支原體感染。
　　 因此，許多科學(xué)家開始進(jìn)行無血清培養(yǎng)基的研究。無血清培養(yǎng)基是加入成分明確的血清替代成分，既能滿足細(xì)胞的培養(yǎng)要求，又能有效避免因使用血清帶來的諸多不利因素。因而無血清培養(yǎng)基得到了越來越普遍的應(yīng)用，無血清細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究日益得到人們的

5、重視。
　　 綜上所述，本研究將致力于肝細(xì)胞的無血清培養(yǎng)研究。通過無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)C3A細(xì)胞系，使其與傳統(tǒng)的血清培養(yǎng)，在細(xì)胞數(shù)量、活力和功能等方面，達(dá)到同樣的效果，從而解決了血清的存在帶來的種種弊端，同時為肝細(xì)胞用于臨床治療以及生物人工肝走入臨床奠定基礎(chǔ)。具體包括以下兩部分研究內(nèi)容:
　　 一:一種適合肝細(xì)胞生長的無血清培養(yǎng)基;
　　 二:四種無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)C3A細(xì)胞的比較研究。
　　 第一部分:一種適

6、合肝細(xì)胞生長的無血清培養(yǎng)基
　　 目的:
　　 研發(fā)一種適用于肝細(xì)胞(C3A)生長的無血清培養(yǎng)基，為肝細(xì)胞用于臨床治療以及生物人工肝走入臨床奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 實驗按細(xì)胞培養(yǎng)基的不同分為3組:分別為無血清培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng);采取逐步降低血清濃度的方法培養(yǎng)C3A細(xì)胞，使細(xì)胞耐受培養(yǎng)基的改變以及適應(yīng)無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng);細(xì)胞穩(wěn)定后，觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，細(xì)胞生長曲線和活力曲線觀察，全自

7、動生化分析儀測定上清中ALT漏出量、尿素含量，放射免疫分析法檢測白蛋白分泌量，實時熒光定量PCR檢測基因水平的變化情況。
　　 結(jié)果:
　　 三組培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)均正常，細(xì)胞生長旺盛，胞漿透亮豐富，貼壁情況良好;細(xì)胞在接種24小時后開始增長，隨著時間的推移，細(xì)胞數(shù)逐漸增多達(dá)到最大值后逐漸下降。實驗組與陰性對照組，細(xì)胞生長至第五天到達(dá)最大值，分別為(2.98±0.032)×106和(1.90±0.091)×106，然后

8、開始下降;而陽性對照組，細(xì)胞生長至第七天達(dá)到峰值，為(3.50±0.060)×106。實驗組和陽性對照組的細(xì)胞增長速度相近，細(xì)胞密度在培養(yǎng)周期內(nèi)，除第六、七天(p=0.000，p=0.000)以外，無明顯差異(p＞0.05)。而在培養(yǎng)的第三天至第八天，明顯高于陰性對照組(P=0.000);培養(yǎng)的第五天開始，無血清培養(yǎng)基組和完全培養(yǎng)基組的細(xì)胞活力無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.429)并明顯高于基礎(chǔ)培養(yǎng)基(P＜0.001);無血清培養(yǎng)基組的尿素合成

9、水平在培養(yǎng)的第二天起明顯高于其余兩組(P＜0.001)，而完全培養(yǎng)基組的尿素水平高于基礎(chǔ)培養(yǎng)基組(P＜0.001);三組培養(yǎng)基組的白蛋白分泌量有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001)，但觀察白蛋白分泌量，三者較為接近，說明無血清培養(yǎng)基能維持較好的細(xì)胞功能。Real-timeqPCR顯示，無血清培養(yǎng)基組相對于完全培養(yǎng)基組，UGT、GST、AFP和ALB基因表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.640，0.075,0.504,1.000)，而CK18、CK19

10、和HNF4α基因表達(dá)量下降(P＜0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 研制了一種適合于肝細(xì)胞(C3A)生長的無血清培養(yǎng)基，其與傳統(tǒng)的血清培養(yǎng)在細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞活力以及細(xì)胞功能等方面能達(dá)到同樣的效果，為肝細(xì)胞用于臨床治療以及生物人工肝走入臨床奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分:四種無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)C3A細(xì)胞的比較研究
　　 目的:
　　 本研究通過四種無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)肝細(xì)胞(C3A)的效果對比，找出最適合于肝

11、細(xì)胞的生長，并能最大發(fā)揮肝細(xì)胞功能的無血清培養(yǎng)基，為生物人工肝種子細(xì)胞的培養(yǎng)、篩選和應(yīng)用以及生物人工肝走入臨床奠定了基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 實驗按細(xì)胞培養(yǎng)基的不同分為6組:分別為A組:HepatoZYME-SFM培養(yǎng)基組;B組:William'sMediumE培養(yǎng)基組;C組:DMEM/F12培養(yǎng)基添加ITS、EGF、Nicotinamide、Asc2P、地塞米松、L-脯氨酸等組分;D組:自主研發(fā)無血清培養(yǎng)基;E組:完

12、全培養(yǎng)基（陽性對照組）;F組:基礎(chǔ)培養(yǎng)基（陰性對照組）:采取逐步降低血清濃度的方法培養(yǎng)C3A細(xì)胞，使細(xì)胞耐受培養(yǎng)基的改變以及適應(yīng)無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng);細(xì)胞穩(wěn)定后，觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，細(xì)胞生長曲線和活力曲線觀察，全自動生化分析儀測定上清中ALT漏出量、尿素含量，放射免疫分析法檢測白蛋白分泌量，實時熒光定量PCR檢測基因水平的變化情況。
　　 結(jié)果:
　　 六組培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞生長良好，生長曲線觀察，細(xì)胞在接種24小時后開始增

13、長，隨著時間的推移，細(xì)胞數(shù)逐漸增多達(dá)到最大值后逐漸下降。A、B、C、D、F組，細(xì)胞生長至第五天到達(dá)最大值，分別為(1.40±0.060)×106、(2.48±0.041)×106、(3.01±0.050)×106、(2.98±0.032)×106和(1.90±0.091)×106，然后開始下降;而E組細(xì)胞生長至第七天達(dá)到峰值，為(3.50±0.060)×106。C組細(xì)胞在培養(yǎng)初期生長較快，細(xì)胞數(shù)明顯高于其他組(p＜0.001)，第四天開

14、始，E組的細(xì)胞密度超過C組，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異(p=0.000);A組的細(xì)胞密度由第三天開始明顯低于其他組(p＜0.001)，且一直保持較低水平，且一直保持較低水平;B、F兩組的細(xì)胞密度接近，處于中間水平;D組細(xì)胞除第六、七天外，與E組細(xì)胞密度無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05);細(xì)胞活力觀察，E組的細(xì)胞活力一直保持于最高水平，于培養(yǎng)的前三天明顯高于其他五組(p＜0.001)，由第五天開始，B、F組細(xì)胞活力無顯著性差異(p=0.910)而明顯低于

15、其他組(B與A、C、D、E組:p=0.005，0.007，0.000，0.001)，A組細(xì)胞活力處于中間水平;C、D兩組的細(xì)胞活力處于較高水平，無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05);細(xì)胞功能檢測，ALT漏出量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。F組的ALT漏出量由第三天開始明顯升高并顯著高于其余五組(P＜0.001)，最高達(dá)到(80.000±7.321)IU/L，細(xì)胞較早出現(xiàn)損傷;A組的ALT漏出量于第六天開始明顯升高，并顯著高于其余四組(P＜0.001)

16、，最高達(dá)到(53.167±2.483)IU/L;B、C、D、E組的ALT漏出量較為接近，一直保持于較低水平，;而尿素檢測結(jié)果顯示，D組的尿素分泌量除第一天低于E組(p=0.000)外一直處于最高水平，顯著高于其余5組(P＜0.001);E組的尿素分泌量于培養(yǎng)周期內(nèi)，明顯高于A、B、C、F四組(P＜0.001);C組的尿素分泌量明顯高于A、B、F三組(P＜0.001)，而低于D、E兩組(P＜0.001);A、B、F三組的尿素分泌量一直處于

17、較低水平;白蛋白結(jié)果顯示，D、E兩組的白蛋白的分泌量雖然有顯著性差異(P＜0.001)，但觀察兩組的分泌量，較為接近，且處于較高水平;A、C組的白蛋白分泌量較低;B組的白蛋白分泌量處于中間水平。熒光定量PCR結(jié)果顯示:UGT在各組(A、B、C、D、F)中的表達(dá)較完全培養(yǎng)基組（E組）都無統(tǒng)計學(xué)差異(p=0.774，0.866，0.197，0.877，0.293);GST、ALB的表達(dá)除A組(p=0.000，0.000)外，其余各組與完全培

18、養(yǎng)基組均無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05);AFP的表達(dá)在A、B、C、D、E組基本相同(p＞0.05)，而F組顯著低于E組(p=0.041);A、D組的HNF4α表達(dá)量均低于完全培養(yǎng)基組(p=0.002，p=0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 本課題組研制的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的無血清培養(yǎng)基能通過各種機制在肝細(xì)胞培養(yǎng)過程中有效地代替血清成分，細(xì)胞生長良好，細(xì)胞形態(tài)、密度、活力、功能與含血清培養(yǎng)基基本相同，最適合于肝細(xì)胞(C3A)的