肝切除患者血清對hiPSCs向肝細(xì)胞分化及肝細(xì)胞增殖影響的實驗研究.pdf

1、肝功能衰竭是肝病患者重要死亡原因之一，目前最有效的治療措施是原位肝移植，但供肝短缺限制了其臨床應(yīng)用。肝細(xì)胞移植及生物型人工肝(BAL)作為肝移植的替代或補(bǔ)充治療手段，所需的肝細(xì)胞也面臨著來源緊缺、體外增殖困難、功能很快喪失等問題。尋找合適的細(xì)胞來源已成為限制肝細(xì)胞移植及BAL臨床應(yīng)用的瓶頸。胚胎干細(xì)胞(ESCs)可以誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞，但ESCs存在倫理學(xué)及異體免疫排斥問題，誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSCs)避免了倫理問題，且由患者體細(xì)胞誘導(dǎo)

2、生成的iPSCs應(yīng)用于患者自身有可能避免免疫排斥反應(yīng)。有望成為肝細(xì)胞移植及BAL所需肝細(xì)胞的理想來源。雖然目前已成功將iPSCs誘導(dǎo)生成肝細(xì)胞，但誘導(dǎo)效率及生成的肝細(xì)胞功能都很低，無法滿足進(jìn)一步基礎(chǔ)和臨床研究需要。
　　目的:1.建立穩(wěn)定的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSCs)維持培養(yǎng)體系及誘導(dǎo)hiPSCs向肝細(xì)胞分化的方法;2.通過采用肝切除患者不同時間血清代替胎牛血清(FBS)，提高誘導(dǎo)hiPSCs向肝細(xì)胞分化效率及生成的肝細(xì)胞功能

3、;3.初步探討人血清在維持肝細(xì)胞培養(yǎng)中代替FBS的可行性以及肝切除術(shù)后血清與肝細(xì)胞增殖的時效關(guān)系。
　　方法:1.采用CF-1小鼠成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，在DMEM/F12培養(yǎng)基中添加堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)及B-巰基乙醇等進(jìn)行飼養(yǎng)層培養(yǎng);采用mTeSR1培養(yǎng)基聯(lián)合Matrigel基質(zhì)膠進(jìn)行無飼養(yǎng)層培養(yǎng)。2.模擬體內(nèi)ESCs向肝細(xì)胞分化過程經(jīng)歷定型內(nèi)胚層、肝前體細(xì)胞及成熟肝細(xì)胞等3個階段，在不同階段分別添加bFGF、活

4、化素A，肝細(xì)胞生長因子(HGF)、地塞米松等不同的細(xì)胞因子或激素，建立體外誘導(dǎo)hiPSCs向肝細(xì)胞分化的誘導(dǎo)體系。3.應(yīng)用實驗二建立的hiPSCs向肝細(xì)胞分化的階段誘導(dǎo)方法，根據(jù)采用FBS或肝切除術(shù)前及術(shù)后3小時、1天、3天不同時間血清分為FBS組、PRE-HS組、POST3H-HS組、POSTlD-HS組、POST3D-HS組，誘導(dǎo)hiPSCs向肝細(xì)胞分化，并通過流式細(xì)胞儀、免疫熒光染色、白蛋白分泌及尿素合成功能、糖原合成功能、吲哚青

5、綠攝取功能檢測各組誘導(dǎo)生成肝細(xì)胞的功能及誘導(dǎo)效率。4.分別采用FBS及肝切除患者術(shù)前及術(shù)后0.5小時、3小時、24小時、72小時不同時間血清維持HL-7702細(xì)胞培養(yǎng)，通過Cell-IQ活細(xì)胞影像分析系統(tǒng)及BrdU免疫熒光染色比較不同血清對HL-7702細(xì)胞增殖能力的影響。
　　結(jié)果:1.飼養(yǎng)層培養(yǎng)和無飼養(yǎng)層培養(yǎng)hiPSCs傳代數(shù)代后堿性磷酸酶染色及Oct4免疫熒光染色均呈陽性，提示兩種培養(yǎng)方法均可維持hiPSCs的多能性及無限增

6、殖能力。2.成功建立了穩(wěn)定的hiPSCs向肝細(xì)胞分化的階段誘導(dǎo)方法，誘導(dǎo)效率為18.1％，誘導(dǎo)生成的細(xì)胞能夠表達(dá)肝細(xì)胞特異性標(biāo)志物去唾液酸糖蛋白酶受體(ASGPRl)、白蛋白(ALB)及甲胎蛋白(AFP)，而且具備一定的糖原合成和吲哚青綠攝取功能。3.流式細(xì)胞儀檢測顯示POST3H-HS、POSTlD-HS組誘導(dǎo)效率明顯高于FBS組;ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液ALB濃度顯示人源性血清誘導(dǎo)生成的細(xì)胞ALB濃度明顯高于FBS組(P＜0.0

7、5)，POST3H-HS和POSTlD-HS組又明顯高于PRE-HS組(P＜0.05):化學(xué)比色法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液尿素濃度顯示PRE-HS，POST3H-HS和POSTlD-HS組尿素濃度高于FBS組(P＜0.05)，POST3H-HS和POSTlD-HS組高于PRE-HS組(P＜0.05);免疫熒光染色結(jié)果顯示:人源性血清誘導(dǎo)生成的細(xì)胞ALB表達(dá)強(qiáng)度明顯強(qiáng)于FBS誘導(dǎo)生成的細(xì)胞，POST3H-HS和POSTlD-HS組強(qiáng)于PRE-H

8、S組;POST3H-HS和POSTlD-HS組AFP表達(dá)強(qiáng)度較FBS組、PRH-HS組更強(qiáng);POST3H-HS和POSTlD-HS組糖原合成功能及吲哚青綠攝取功能強(qiáng)于FBS組和PRE-HS組。4.Cell-IQ活細(xì)胞影像分析結(jié)果顯示，各組人源性血清培養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)明顯高于FBS組(P＜0.05)，術(shù)后0.5h和術(shù)后3h血清組明顯高于術(shù)前血清組(P＜0.05)。BrdU免疫熒光染色顯示人源性血清培養(yǎng)的細(xì)胞BrdU陽性率均高于FBS培養(yǎng)的細(xì)