CHO細胞無血清培養(yǎng)基的研究與應用.pdf

1、本實驗室已研制出的流感病毒、肝炎病毒中和抗體具有臨床應用潛力，需要大量的抗體用臨床前研究。此外，診斷試劑盒與疫苗相關研究也需要大量具有天然構象與活性的病毒結構蛋白，需要一個高效、經濟的哺乳動物表達平臺。課題組前期已建立基于CHO-S與HEK293等細胞的瞬時基因表達平臺，表達量分別為15mg/L與80mg/L，課題組還引進了CHO系列中的FIp-In及DHFR-缺陷系統(tǒng)等穩(wěn)定基因表達系統(tǒng)，為外源蛋白高表達提供了條件。
　　但在表達

2、過程中，培養(yǎng)基幾乎占據(jù)了表達成本的一半，大量表達時培養(yǎng)基耗費極大，此外商業(yè)培養(yǎng)基配方保密，如果存在干擾轉染或后續(xù)純化的物質，無法排除，會使工藝變得極為復雜。為解決培養(yǎng)基的問題，本研究首先通過選擇合適的評價體系，確立了各類營養(yǎng)混合液的配制方法與添加閾值，結合文獻、專利報道的添加范圍與其它無血清培養(yǎng)添加因子，通過相互組合形成基礎培養(yǎng)基庫，篩選獲得L1，M1兩種最有潛力的基礎培養(yǎng)基。通過配方分析，設計了L1與M1的混合測試，培養(yǎng)效果得到極大提

3、高，最高活細胞密度提高3倍，培養(yǎng)周期延長到6天以上。
　　本研究還發(fā)現(xiàn)，PVA可以減少細胞因為剪切力傷害造成的細胞破碎，還具有促進細胞增殖的效果，結合硫酸葡聚糖以及微量元素混合液的使用，細胞在含PVA的培養(yǎng)基中不會相互聚集成團或貼附在瓶壁上，生長狀態(tài)得到極大改善。本研究還對培養(yǎng)基的配制順序進行分析與測試，確定最佳配制順序后通過調節(jié)NaCl的含量最終獲得了最優(yōu)培養(yǎng)基L1/M1，在后期培養(yǎng)、表達驗證中，該培養(yǎng)基適用于細胞傳代培養(yǎng)、凍存

4、以及復蘇。通過去除TFR以及在L1基礎上添加BSA與Yeast extract還獲得了能夠較好支持細胞培養(yǎng)的L1/M1-TFR與L1YB培養(yǎng)基，以上三種培養(yǎng)基的成本相較于商業(yè)培養(yǎng)基降低三分之二以上，為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)提供便利。
　　本研究通過配方分組測試，迅速排除了干擾轉染的物質，使用L1/M1表達多種抗體和蛋白，表達量優(yōu)于商業(yè)培養(yǎng)基，產物活性一致。其中10F7cAb的表達量達到119.8mg/L，比商業(yè)培養(yǎng)基提高87.2％，通