基于Tubespin生物反應器的CHO細胞無血清培養(yǎng)基的高通量篩選與優(yōu)化.pdf

1、隨著重組蛋白藥物和單克隆抗體藥物的迅猛發(fā)展，CHO細胞大規(guī)模培養(yǎng)作為商業(yè)化生產(chǎn)單抗等需要糖基化修飾的、結(jié)構(gòu)復雜蛋白質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)已被廣泛研究，其中細胞無血清培養(yǎng)基的篩選和優(yōu)化一直是該領(lǐng)域研究的熱點。本研究針對CHO DG44細胞系，采用高通量縮小反應器Tubespin和二氧化碳箱式搖床ISF4-X構(gòu)建了一個無血清培養(yǎng)基高通量篩選平臺，優(yōu)化了Tubespin培養(yǎng)細胞的條件，并通過對CHO細胞批次培養(yǎng)的代謝分析和關(guān)鍵添加組分的篩選，得到了兩種

2、高效能原創(chuàng)CHO細胞無血清培養(yǎng)基配方，為將來大規(guī)模單克隆抗體生產(chǎn)平臺的建立提供技術(shù)支撐。
　　我們首先通過實驗對比，選定DF12作為無血清培養(yǎng)基優(yōu)化的起始培養(yǎng)基，采用Tubespin反應器對CHO DG44細胞培養(yǎng)的細胞接種密度和培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速進行了優(yōu)化，得到最優(yōu)培養(yǎng)條件為180rpm/min，10ml，37℃，5％CO2，接種密度0.3×105cells/ml，并通過添加25mg/L硫酸葡聚糖成功解決了細胞高密度(8.117×10

3、6cells/ml)懸浮培養(yǎng)時的成團問題。
　　ITS（胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，亞硒酸鈉）是CHO DG44細胞培養(yǎng)的最重要添加物，我們采用中心復合設計法對ITS進行響應面分析，得到最適合CHO DG44細胞培養(yǎng)的最優(yōu)ITS添加濃度分別為胰島素20mg/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白10mg/L，亞硒酸鈉25μg/L。我們并成功使用低成本的鹽混合液（16mg/L檸檬酸鐵，1mg/L硫酸鋅，25μg/L亞硒酸鈉）替代了ITS。我們還采用Plackett-B

4、urman法對11種關(guān)鍵添加組分進行了篩選，發(fā)現(xiàn)對細胞生長促進作用最顯著的三個組分依次是還原性谷胱甘肽、腐胺、白蛋白。
　　AQC柱前衍生RP-HPLC法用于分析不同培養(yǎng)基批次培養(yǎng)前后17種氨基酸含量變化，發(fā)現(xiàn)消耗量較大的氨基酸主要有天冬氨酸，絲氨酸，精氨酸，組氨酸，半胱氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸等，其中半胱氨酸基本耗盡。根據(jù)初始氨基酸成分對比和氨基酸消耗情況我們設計了兩種混合氨基酸配方進行氨基酸優(yōu)化實驗，與對照組相比，細胞生長密度均