微液滴酶反應(yīng)器超高通量篩選體系的建立.pdf

1、酶是高效、高選擇性、環(huán)境友好的生物催化劑，在化工、醫(yī)藥、能源、食品、環(huán)保等領(lǐng)域發(fā)揮著日益重要的作用，工業(yè)生產(chǎn)對酶的種類和性能的要求也越來越多樣化。利用宏基因組技術(shù)從天然環(huán)境中挖掘新酶基因，以及利用分子定向進(jìn)化技術(shù)對現(xiàn)有酶制劑進(jìn)行分子改造，是獲得性質(zhì)優(yōu)良的新酶源的主要途徑。高通量篩選方法可以對大容量基因文庫進(jìn)行高效篩選，是從酶突變庫及環(huán)境宏基因組庫中獲得極少數(shù)所需個(gè)體的核心關(guān)鍵技術(shù)，因此受到國際學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。
　　基于單細(xì)胞微反

2、應(yīng)器的酶超高通量篩選體系是近年來新興的技術(shù)體系，它在皮升級的微液滴中進(jìn)行單細(xì)胞酶反應(yīng)，并通過流式細(xì)胞儀或微流控芯片進(jìn)行分析和篩選，其篩選通量可高達(dá)108/天。而且，由于微反應(yīng)器的體積比常規(guī)微孔板體系減少了百萬倍以上，從而大大降低了篩選的試劑成本。然而，基于單細(xì)胞微反應(yīng)器的酶篩選技術(shù)目前仍存在一系列問題，表現(xiàn)為：（1）基于微液滴的微反應(yīng)器均一度較差，從而影響酶活性定量及篩選效率；（2）用于微反應(yīng)器檢測和分選的流式細(xì)胞儀價(jià)格昂貴，限制了該體

3、系的廣泛應(yīng)用；（3）由于篩選底物種類較少，可用微反應(yīng)器篩選體系進(jìn)行篩選的酶種類有限。為解決上述問題，本論文開展了以下工作：
　?。?）高均一度的單細(xì)胞“水-油-水”微反應(yīng)器制備：針對常規(guī)勻漿法制備微反應(yīng)器均一度差的缺點(diǎn)，本論文利用膜擠出儀開發(fā)了新的“水-油-水”微液滴制備方法，生成的微液滴均一度顯著提高，從而極大地提高了酶活性定量的準(zhǔn)確度，能夠有效區(qū)分酶活性差別在2倍以內(nèi)的樣品。本論文利用該體系，成功實(shí)現(xiàn)了嗜熱酯酶 AFEST的定

4、向進(jìn)化：通過對容量達(dá)200萬的隨機(jī)突變庫進(jìn)行僅一輪篩選，便獲得了酶活性提高了兩倍的陽性突變體，其催化效率接近分子擴(kuò)散效率的極限。突變體保持了野生型酶優(yōu)良的熱穩(wěn)定性及拓寬的底物譜，對藥物中間體7-氨基頭孢烷酸的水解活性也提高3倍，體現(xiàn)了該酶在頭孢類抗生素的酶法合成中的工業(yè)應(yīng)用潛力。
　　（2）基于微流控芯片的“水-油”微反應(yīng)器雙色熒光分選：微流控芯片具有成本低、體系靈活等優(yōu)點(diǎn)，能夠在極小的體積上整合液滴生成、操縱、分析等整套功能，為

5、酶高通量篩選帶來了新的契機(jī)。本論文開發(fā)了基于微流控芯片的“水-油”微反應(yīng)器雙色熒光檢測分選體系，可同時(shí)考察兩種熒光信號變化，篩選通量高達(dá)1400/秒，在酶的底物特異性、立體選擇性、區(qū)位選擇性等功能的篩選中具有重要應(yīng)用潛力。應(yīng)用該體系，本論文成功對酯酶AFEST的立體選擇性進(jìn)行了定向進(jìn)化，獲得了對重要抗炎藥物S型異丙基布洛芬活性和立體選擇性都顯著提高的陽性突變體。
　?。?）“熒光微液滴捕獲”底物設(shè)計(jì)策略：為了提高微反應(yīng)器篩選體系在