FXR激動(dòng)劑高通量藥物篩選模型的建立及應(yīng)用.pdf

1、本研究為尋找治療心血管疾病以及糖尿病藥物的先導(dǎo)化合物，利用哺乳動(dòng)物單雜交技術(shù)與高通量篩選技術(shù)在細(xì)胞水平上，建立了以FXR為靶點(diǎn)的FXR激動(dòng)劑的高通量篩選模型，為尋找治療血脂異常疾病藥物的先導(dǎo)化合物開(kāi)辟了道路。 從肝細(xì)胞的總RNA中，利用RT-PCR擴(kuò)增FXR-LBD基因，將此DNA序列連接到pBind載體上構(gòu)建了融合表達(dá)載體pBind-FXR；合成含5個(gè)拷貝的GAL4 DNA結(jié)合序列(GAL4RE)并接到pGl3 promote

2、r載體上構(gòu)建了報(bào)告載體pGl3-GAL4。通過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，通過(guò)測(cè)定報(bào)告基因熒光素酶的表達(dá)，進(jìn)行FXR的激動(dòng)劑功能性篩選。 CDCA是FXR的生理激動(dòng)劑，有較高的激動(dòng)活性，本研究選用CDCA作為篩選模型的陽(yáng)性藥。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化，建立起了穩(wěn)定、靈敏，有較高的信噪比的FXR激動(dòng)劑的高通量篩選模型。在本單雜交模型中，CDCA能明顯提高熒光素酶的表達(dá)，并且在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性增長(zhǎng)，CDCA在

3、50礛時(shí)對(duì)熒光素酶有最大誘導(dǎo)活性，其倍增數(shù)為12。 本研究還進(jìn)一步將FXR的篩選模型進(jìn)行了384孔板的微量化研究，微量化后，F(xiàn)XR激動(dòng)活性對(duì)CDCA仍然呈濃度依賴(lài)增長(zhǎng)關(guān)系，最大的誘導(dǎo)倍增比96孔板有所下降，為5倍。 應(yīng)用此模型對(duì)微生物次生代謝產(chǎn)物庫(kù)中的880個(gè)樣品以及純化合物庫(kù)中的120個(gè)樣品進(jìn)行了篩選，從中得兩個(gè)活性化合物CoQl0和F01WA2076A。 CoQ10能明顯提高熒光素酶的表達(dá)，并且在一定濃度范圍

4、內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性增長(zhǎng)，對(duì)熒光素酶的最大誘導(dǎo)倍增數(shù)為5；F01WA2076A也能明顯提高熒光素酶的表達(dá)，并且在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性增長(zhǎng)，對(duì)熒光素酶的最大誘導(dǎo)倍增數(shù)可達(dá)9以上。 本研究過(guò)程中制備了2608株真菌和1840株放線菌的次生代謝產(chǎn)物共8896個(gè)樣品，供本模型以及其他模型的篩選。 本研究建立的FXR激動(dòng)劑的高通量細(xì)胞篩選模型以及得到兩個(gè)活性化合物CoQ10和F01WA2076A，為FXR相關(guān)疾病的藥物研發(fā)和F