ARIs篩選模型的建立及相關(guān)藥物的篩選.pdf

1、糖尿病是一種伴有諸多嚴(yán)重并發(fā)癥的疾病，在退行性糖尿病并發(fā)癥病變的發(fā)生和發(fā)展過程中，多元醇代謝通路（PP通路）起了十分重要的作用。醛糖還原酶（AR）是多元醇代謝通路中的關(guān)鍵限速酶，是治療糖尿病并發(fā)癥的靶位酶，該酶以NADPH為輔酶，使葡萄糖還原為不易透過細(xì)胞膜的山梨醇，引起細(xì)胞的滲透性損傷，是糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的重要原因。由于目前可用于治療糖尿病并發(fā)癥的藥物不足以滿足臨床需要，現(xiàn)有的醛糖還原酶抑制劑索比尼爾和托瑞司他等有不同程度的副作用。因

2、而發(fā)現(xiàn)和尋找新的安全有效的醛糖還原酶抑制劑顯得非常有必要。本研究的目的就是建立一種簡便、可靠并可以用于高效篩選醛糖還原酶抑制劑的篩選模型，并在模型的基礎(chǔ)上進行了相關(guān)的藥物篩選。 本研究分為四部分： 1、建立了一種醛糖還原酶的提取分離純化的簡易方法。將新鮮牛眼晶狀體剪碎，在3倍體積磷酸鹽緩沖液中手動碾磨；粗提液高速離心除去殘渣，向上清中加入適量飽和（NH4）2SO4，以（NH4）2SO4飽和度為40％、50％和75％進行離

3、心分級鹽析，將最后得到的沉淀用適量緩沖液溶解，用離心超濾法脫鹽純化。用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳對粗酶蛋白液進行鑒定。再用雙縮尿法測定粗酶蛋白的濃度。 2、建立了一種可用于從中藥/天然藥物中篩選醛糖還原酶抑制劑的體外微量篩選模型，并對其進行了條件的優(yōu)化。由于NADPH具有極強的還原性，很容易被氧化，酶促反應(yīng)體系的吸光度隨著NADPH的氧化而逐漸降低，利用此特性可以根據(jù)反應(yīng)體系中NADPH被氧化的量來確定AR的活力。本研究以DL-甘

4、油醛為底物，NADPH為輔酶，應(yīng)用96孔板建立醛糖還原酶抑制劑的微量篩選模型。最終反應(yīng)體系為總體積為300ul，各組分分別為：100ul PH6．2磷酸鉀緩沖液（0．03 mol/L），30ul2-巰基乙醇（0．01mol/L），30ul硫酸鋰（0．2mol/L），18ul NADPH（0．25mmol/L），25ul DL-甘油醛（3．5 mmol/L），40ul（含粗酶約3mg），反應(yīng)溫度為35℃。規(guī)定在340nm處反應(yīng)體系吸光度每

5、分鐘下降0．001為一個酶活力單位，此模型靈敏、高效。反應(yīng)體經(jīng)優(yōu)化后，體系穩(wěn)定，且最終得到的酶活力高達(dá)43．2個單位，可用于藥物的篩選。 3、研究在此模型的基礎(chǔ)上進行了相關(guān)的藥物篩選工作，對120種中藥提取藥物進行篩選，發(fā)現(xiàn)有35中藥提取物明顯能抑制醛糖還原酶的活性（抑制率>15％），17種中藥提取物存在假陽性現(xiàn)象，68種藥物提取無對醛糖還原酶抑制率<15％）。 4、在已篩選的中藥中選擇對醛糖還原酶有較高抑制率的中藥中對

6、其進行粗分，并建立三七總黃酮的初級提取方法及三七總黃酮濃度的檢測方法，三七總黃酮濃度為0．745mg/ml，提取率達(dá)到了0．7％。經(jīng)過實驗研究發(fā)現(xiàn)三七中含有對醛糖還原酶有很高抑制率的物質(zhì)．抑制率達(dá)到了84．3％。 本論文研究建立了醛糖還原酶的提取分離純化、鑒定、粗蛋白濃度測定及活性檢測方法，并建立了醛糖還原酶抑制劑體外篩選模型，為抗糖尿病并發(fā)癥藥物的篩選提供了一種篩選方法，在此模型的基礎(chǔ)上篩選出了幾種能有效抑制醛糖還原酶活性的藥