抗糖尿病藥物篩選模型的建立及應(yīng)用.pdf

1、目的：本研究分別在細(xì)胞和分子水平上建立篩藥模型，用于天然小分子化合物降糖活性的篩選，進(jìn)一步在動(dòng)物模型上證實(shí)其抗糖尿病藥理活性，以期待發(fā)現(xiàn)具有新作用機(jī)制或新結(jié)構(gòu)類型的抗糖尿病藥物：(1)在細(xì)胞水平上建立脂肪細(xì)胞的葡萄糖消耗模型，觀察化合物對(duì)脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗的影響，初篩與胰島素活性相似的小分子化合物；(2)利用報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)，建立基于PPARγ信號(hào)通路的篩選模型，用于初篩具有胰島素增敏活性的小分子化合物；(3)建立ALX致糖尿病小鼠模型

2、，證實(shí)初篩“命中”化合物在動(dòng)物體內(nèi)的降糖活性。 方法：(1)體外脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗模型。選擇3T3-L1前脂肪細(xì)胞株，在96孔板上用體外激素誘導(dǎo)的方法獲得分化成熟的脂肪細(xì)胞，分別用陽(yáng)性對(duì)照品胰島素及待篩化合物刺激細(xì)胞，48h后檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中葡萄糖濃度。結(jié)果以陽(yáng)性對(duì)照品胰島素為參照，初步考察230個(gè)化合物對(duì)脂肪細(xì)胞的葡萄糖消耗是否有促進(jìn)作用；(2)基于PPARγ信號(hào)通路的篩藥模型。將三個(gè)含有不同目的片段PPRE的報(bào)告基因質(zhì)粒分

3、別與表達(dá)PPARγ的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，通過(guò)測(cè)定報(bào)告基因活性來(lái)考察陽(yáng)性對(duì)照藥馬來(lái)酸羅格列酮對(duì)PPARγ信號(hào)通路的影響，選取誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)最高的報(bào)告基因質(zhì)粒和細(xì)胞株建立模型。用其它類型核受體激動(dòng)劑對(duì)此模型進(jìn)行特異性考察。用此模型對(duì)葡萄糖消耗模型中“命中”的63個(gè)化合物進(jìn)行胰島素增敏活性的篩選；(3)ALX致小鼠糖尿病模型。將尾靜脈注射不同劑量ALX的KM小鼠造模，陽(yáng)性對(duì)照品MET按250mg·Kg-1·d-1劑量灌服給藥7d，考察其對(duì)糖尿病

4、模型小鼠血糖的影響，并確定ALX的最佳造模劑量。選出2個(gè)初篩“命中”化合物51、60號(hào)，進(jìn)一步考察其在糖尿病動(dòng)物體內(nèi)的降糖活性。51號(hào)化合物按25、50、100mg·Kg-1·d-1劑量，60號(hào)化合物按12.5、25、50mg·Kg-1·d-1劑量分別灌服給藥5d，以MET作為陽(yáng)性對(duì)照，考察不同劑量化合物對(duì)糖尿病模型小鼠血糖的影響。 結(jié)果：(1)胰島素在0.01～100mg·L-1的濃度范圍內(nèi)都能促進(jìn)體外分化成熟的脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄

5、糖的消耗，且呈現(xiàn)良好的劑量依賴關(guān)系。篩選出63個(gè)化合物有不同程度的促進(jìn)脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗的作用，其中第33、51、96、200、202、211、212、213號(hào)化合物在50mg·L-1及170號(hào)在5mg·L-1濃度時(shí)呈現(xiàn)較強(qiáng)的降糖活性；(2)轉(zhuǎn)染pTK-PPRE-Luc和PPARγ質(zhì)粒的人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞中，Luc的表達(dá)受馬來(lái)酸羅格列酮的誘導(dǎo)活性最高，誘導(dǎo)倍數(shù)可達(dá)4.9倍，并呈現(xiàn)良好的劑量依賴關(guān)系，Z'因子為0.72。其他各類核受體

6、激動(dòng)劑的誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)均在1左右。馬來(lái)酸羅格列酮無(wú)促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。其中，60號(hào)化合物在1mg·L-1濃度時(shí)測(cè)得的Luc誘導(dǎo)表達(dá)率可達(dá)2倍以上，與10μmol·L-1馬來(lái)酸羅格列酮結(jié)果無(wú)顯著性差異(p＞0.05)；(3)ALX以90mg·Kg-1劑量造模時(shí)，糖尿病小鼠模型形成率高，且小鼠死亡率低。51號(hào)化合物以100mg·Kg-1·d-1、60號(hào)化合物以50mg·Kg-1·d-1劑量給小鼠灌服5d后，小鼠血糖明顯下降，與模型對(duì)照組比較有

7、顯著性差異(p＜0.01或p＜0.05)；與MET給藥組的小鼠血糖值比較，無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。 結(jié)論：(1)本課題成功建立二個(gè)體外初篩模型和一個(gè)整體動(dòng)物模型。脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗模型具有成本低、所需樣品量少、篩選效率高等特點(diǎn)，但模型的穩(wěn)定性和特異性存在一定缺陷；基于PPARγ信號(hào)通路的初篩模型，具有靶點(diǎn)單一、機(jī)制明確等特點(diǎn)，模型具較好的特異性和穩(wěn)定性；ALX誘導(dǎo)的小鼠糖尿病模型形成率可達(dá)80％，死亡率低，模型穩(wěn)定性較好；