豬食欲肽受體2激動劑細(xì)胞篩選模型的建立及其應(yīng)用.pdf

1、食欲肽(Orexin)是由下丘腦食欲肽能神經(jīng)元分泌的一類神經(jīng)肽，它能夠在大腦不同區(qū)域高效地表達(dá)，可對動物的能量平衡進(jìn)行有效的調(diào)節(jié)。食欲肽是通過對應(yīng)的受體即食欲肽受體（OX1R和OX2R）發(fā)揮其功能的，它與動物的多種生理功能相關(guān)，但是最主要是在攝食與能量平衡上起到的重要作用。cAMP/PKA信號通路是OXR的經(jīng)典信號通路，當(dāng)其配體（激動劑或拮抗劑）與OXR結(jié)合后，改變細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平，進(jìn)而引起蛋白激酶A(PKA)狀態(tài)的變化，引發(fā)相應(yīng)的

2、生理學(xué)效應(yīng)。
　　目前，雖然關(guān)于OX2R信號通路方面的研究已有報道，但在家畜方面的報道仍比較少，特別是豬，而豬的體重又是重要經(jīng)濟(jì)指標(biāo)。同時，有研究表明OX2R是一種非選擇性的受體，可與其匹配的激動劑范圍更寬泛一些。但關(guān)于以O(shè)X2R為靶點(diǎn)的細(xì)胞篩選模型的建立與應(yīng)用方面的研究卻尚未見報道。
　　本研究在豬OX2R真核表達(dá)質(zhì)粒成功構(gòu)建的基礎(chǔ)上，以cAMP水平變化所建立的報告基因檢測方法為依據(jù)，建立以豬OX2R為靶點(diǎn)的穩(wěn)定、可靠的豬

3、OX2R激動劑細(xì)胞篩選模型，對選取的部分中藥的提取物進(jìn)行篩選，用來發(fā)現(xiàn)一些其他非內(nèi)源性的激動劑，為篩選提高豬的生產(chǎn)效率的先導(dǎo)化合物及相關(guān)藥物的研發(fā)做一些基礎(chǔ)性的研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1、將豬OX2R真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R與熒光素酶報告基因質(zhì)粒PGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]以1∶5的比例共轉(zhuǎn)染到CHO-K1細(xì)胞，通過G418(800μg/ml)和潮霉素B(400μg/ml)進(jìn)

4、行抗性篩選并利用有限稀釋法得到螢火蟲熒光素酶的相對表達(dá)量最高的一株單克隆株作為陽性細(xì)胞株;提取其總RNA，RT-PCR后在預(yù)期位置擴(kuò)增出豬OX2R基因(1332bp)的目的條帶，同時，通過加Foskolin檢測螢火蟲熒光素酶表達(dá)量的變化，證實了螢火蟲熒光素酶基因的成功轉(zhuǎn)入。
　　2、將pcDNA3.1(+)空載體和PGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]熒光素酶報告基因質(zhì)粒以1∶5的比例按上述方法共轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞株，

5、按1方法得到熒光素酶表達(dá)量最高且背景值較低的單克隆株作為陰性細(xì)胞株。同時，通過轉(zhuǎn)染后加Foskolin檢測螢火蟲熒光素酶表達(dá)量的變化，證實了螢火蟲熒光素酶基因的成功轉(zhuǎn)入。陰性細(xì)胞株用于內(nèi)源性受體及假陽性激動劑的排除。
　　3、對所選陽性單克隆細(xì)胞篩選模型進(jìn)行條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)激動劑OXB終濃度為10-6mol/L，孵育時間為9h，溶劑DMSO終濃度小于等于3％及檢測試劑Luciferase AssayReagent用量為原液的1/2

6、時，篩選模型Z因子值為0.85，說明建立的篩選方法可靠、穩(wěn)定，可用于OX2R激動劑的篩選。
　　4、分別利用醇提法與水提法對18種天然中藥進(jìn)行有效成分提取，得到36種天然提取物樣品，利用建立的豬OX2R穩(wěn)定細(xì)胞株進(jìn)行激動劑的篩選并利用陰性細(xì)胞株排除了假陽性天然提取物樣品，得到本底比大于2的提取物樣品共3種，其中醇提物2種，水提物1種;利用HEK293T細(xì)胞進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染對得到的3種陽性提取物樣品進(jìn)行劑量效應(yīng)關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)在一定濃度