培養(yǎng)基及其制備

1、第二章 培養(yǎng)基的制備與滅菌,,1、培養(yǎng)基的組成？如何選擇培養(yǎng)基？ 2、如何制備培養(yǎng)基？ 3、如何對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌？,第一節(jié) 培養(yǎng)基的原材料,一、培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分及用途 光 光能自養(yǎng) 自養(yǎng)菌 氫、硫、氨 化能自養(yǎng) 1.能源 亞硝酸鹽、亞鐵鹽

2、 碳水化合物等有機(jī)物 石油天然氣和石油化工產(chǎn)品（如醋酸） 異養(yǎng)菌 功能：生長(zhǎng)、繁殖需要；,,,,,,碳酸氣 2.碳源 淀粉水解糖、糖蜜、亞硫酸鹽紙漿廢液等 石油、正構(gòu)石蠟、天然氣 醋酸、甲醇、乙醇等石油化工產(chǎn)品 功能：提供能量、構(gòu)成菌體、代謝產(chǎn)物的物質(zhì)基礎(chǔ)；,,,有機(jī)氮：黃豆餅粉、花生餅粉、玉米漿、蛋白胨、

3、3.氮源 酵母粉、魚(yú)粉、發(fā)酵菌絲體、酒糟水等 無(wú)機(jī)氮： 尿素、硫酸銨、氨水、硝酸鹽功能：構(gòu)成菌體、含氮代謝物；,,,磷酸鹽、鉀鹽、鈣鹽等礦物鹽4.無(wú)機(jī)鹽 鐵、錳、鈷等微量元素 功能：構(gòu)成菌體，參與酶的組成，維持酶活性，調(diào)節(jié)滲透壓，調(diào)節(jié)pH值，維持氧化還原電位；,,,5.特殊生長(zhǎng)因子：硫胺素、生物素、對(duì)氨基苯甲酸、肌醇等

4、功能：酶的輔助部分，維持生命活動(dòng)；,,6．發(fā)酵的促進(jìn)劑與抑制劑發(fā)酵培養(yǎng)基中某些成分的加入有利于調(diào)節(jié)產(chǎn)物的形成，而并不促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，這些物質(zhì)包括前體、促進(jìn)劑和抑制劑,,1）、前體：指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過(guò)程中結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)沒(méi)有多大的變化，但產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大的提高。 如：在青霉素生產(chǎn)中加入玉米漿，青霉素產(chǎn)量可從20u/mL增加到100u/mL，研究發(fā)現(xiàn)玉米漿中

5、的苯乙胺被有限結(jié)合到青霉素分子中，從而提高了青霉素G的產(chǎn)量。,,2）、促進(jìn)劑：指那些既不是營(yíng)養(yǎng)物又不是前體，但卻能提高產(chǎn)量的添加劑。比如在酶制劑發(fā)酵過(guò)程中，加入誘導(dǎo)物、表明活性劑及其它一些產(chǎn)酶促進(jìn)劑（比如吐溫80、植酸、洗衣粉等）,,3）、抑制劑：在發(fā)酵過(guò)程中加入抑制劑會(huì)抑制某些代謝途徑的進(jìn)行，同時(shí)會(huì)使另外一些代謝途徑活躍，從而獲得人們所需要的某種產(chǎn)物或使正常代謝的某一代謝中間物積累起來(lái)。 例如：微生物發(fā)酵生產(chǎn)甘油中，例如

6、亞硫酸氫鈉，它與代謝過(guò)程中的乙醛生成加成物。,,7.水分功能：生化反應(yīng)均在水溶液中進(jìn)行,二、培養(yǎng)基的類型,1.依營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的來(lái)源分類天然培養(yǎng)基；合成培養(yǎng)基，也稱組合培養(yǎng)基（多用于定量研究）；半合成培養(yǎng)基，（用的最多，在部分天然有機(jī)碳源、氮源、生長(zhǎng)因子的基礎(chǔ)上，適當(dāng)加入一些化學(xué)藥品）；,,2.依培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來(lái)分：1）固體培養(yǎng)基A、凝固培養(yǎng)基 ：即遇熱可融化，冷卻后則凝固的固體培養(yǎng)基B、非可逆性凝固培養(yǎng)基：指有血清凝固成的固

7、體培養(yǎng)基或由無(wú)機(jī)硅膠配成的凝固后即不能再融化的固體培養(yǎng)基C、天然固體培養(yǎng)基：由天然固體狀基質(zhì)直接制成的培養(yǎng)基，如麩皮，米糠，木屑等D、濾膜：是一種堅(jiān)韌且?guī)в袩o(wú)數(shù)微孔的醋酸纖維薄膜，把它制成圓片狀覆蓋再營(yíng)養(yǎng)瓊脂或浸有培養(yǎng)液的纖維襯墊上，就形成了具有固體培養(yǎng)基性質(zhì)的培養(yǎng)條件。,,2）半固體培養(yǎng)基 配置好的液體培養(yǎng)基中加入0.5%左右的瓊脂作為凝固劑，形成的培養(yǎng)基稱之微半固體培養(yǎng)基。 主要用于菌種鑒定，觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)特征及噬菌體

8、的效價(jià)測(cè)定等,,3）液體培養(yǎng)基；培養(yǎng)基中80～90%是水。,,3.依培養(yǎng)基的用途來(lái)分1）、孢子培養(yǎng)基2）、種子培養(yǎng)基3) 、 發(fā)酵培養(yǎng)基4）、補(bǔ)料培養(yǎng)基5）、加富培養(yǎng)基6）、選擇培養(yǎng)基7）、鑒別培養(yǎng)基8）、增殖和保存培養(yǎng)基9）、富集培養(yǎng)基10）、測(cè)定培養(yǎng)基,三、發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇,一）、配置培養(yǎng)基的原則1、根據(jù)不同微生物的營(yíng)養(yǎng)需要配置不同的培養(yǎng)基2、注意各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度和配比3、調(diào)節(jié)適宜的物理化學(xué)條件4、根據(jù)

9、培養(yǎng)微生物的目的配置5、盡量使用廉價(jià)易得的原料,1、生態(tài)模擬2、查閱文獻(xiàn)3、借助優(yōu)選法或正交試驗(yàn)法精心設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方4、實(shí)驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)的規(guī)模一般由定性到定量，由小到大。發(fā)酵培養(yǎng)基的用途與要求、成分、配比經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定，配制時(shí)兼顧原料來(lái)源、成本及工藝管理；（舉例1 ，2，3）,二）、配置培養(yǎng)基的方法,培養(yǎng)基配方舉例,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(常用的細(xì)菌培養(yǎng)基) 牛肉膏5克 蛋白胨10克 NaCl5克 水1000毫升 pH7.2～7

10、.4 (瓊脂15～20克)高氏一號(hào)培養(yǎng)基(常用的放線菌培養(yǎng)基) 可溶性淀粉20克 KNO31克 K2HPO40.5克 MgSO40.5克 NaCl 0.5克 FeSO40.01克水1000毫升瓊脂15～20克pH7.4～7.6,,察氏培養(yǎng)基(培養(yǎng)霉菌用) 蔗糖 20克 NaNO33克 K2HPO41克 KCl1克 MgSO40.5克 FeSO40.01克 瓊脂20克 水1000毫升自然pH無(wú)氮培養(yǎng)基(培養(yǎng)自生固

11、氮菌用) 葡萄糖 10克 NaCl0.2克 KH2PO40.2克 CaSO4·2H2O0.1克 MgSO40.2克 CaCO35克 瓊脂 20克水1000毫升自然pH伊紅-美藍(lán)培養(yǎng)基(檢查腸道細(xì)菌用) 蛋白胨 10克 K2HPO42克乳糖10克瓊脂25克，水1000毫升，pH7.6 2％伊紅水溶液2毫升0.5％美藍(lán)水溶液2毫升將乳糖、伊紅、美藍(lán)分別滅菌后，加入滅菌的培養(yǎng)基中搖勻，倒平板。,,四、原料轉(zhuǎn)換及

12、意義1、節(jié)約原料，減低單耗，提高發(fā)酵單位和總收率；2、開(kāi)拓新的原料資源和微生物資源：野生植物淀粉、植物纖維、木屑水解物、石蠟、醋酸、乙醇,第二節(jié) 淀粉水解糖的制備,一、淀粉水解糖的制備方法1、酸解法：定義：以酸（無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸）為催化劑，在高溫高壓下將淀粉水解為葡萄糖的方法.優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備要求簡(jiǎn)單，水解時(shí)間短（20min），設(shè)備生產(chǎn)能力大缺點(diǎn)：高溫高壓下進(jìn)行，設(shè)備要求耐腐蝕、耐高溫、耐高壓，副反應(yīng)多，對(duì)原料要求嚴(yán)格，淀粉顆

13、粒不宜過(guò)大，淀粉乳濃度不能過(guò)高。,,2、酶解法：（雙酶水解法） 定義：用淀粉酶將淀粉水解為葡萄糖的過(guò)程。一般分為兩步：第一步是利用α－淀粉酶將淀粉液化轉(zhuǎn)為糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，這個(gè)過(guò)程稱為液化。第二步是利用糖化酶將糊精或低聚糖進(jìn)一步水解，轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟堑倪^(guò)程，稱為糖化。也稱雙酶法,,α-淀粉酶（液化）葡萄糖淀粉酶（糖化）優(yōu)點(diǎn)：1、反應(yīng)條件溫和。 2、酶的專一性強(qiáng)，副反應(yīng)少

14、3、可在較高的淀粉乳濃度下水解 4、糖液的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富 5、糖液色澤淺，無(wú)苦味，有利于糖液的精制缺點(diǎn)：時(shí)間長(zhǎng)（2～3）天，要求的設(shè)備多，糖液過(guò)濾困難。,,3、酸酶結(jié)合法酸酶法酶酸法,二、淀粉酸水解理論基礎(chǔ),淀粉水解成葡萄糖的反應(yīng)過(guò)程中同時(shí)發(fā)生這：水解反應(yīng)、復(fù)合反應(yīng)、分解反應(yīng)；其中水解反應(yīng)是主要的。復(fù)合反應(yīng)：葡萄糖分子間經(jīng)1-6糖苷鍵結(jié)合成龍膽二糖（有苦味）、異麥芽糖和其他低聚糖（合

15、稱復(fù)合低聚糖）。分解反應(yīng)：葡萄糖 羥甲基糠醛 有機(jī)酸、色素等,,,,㈠淀粉的水解反應(yīng)1.淀粉水解過(guò)程顏色變化：藍(lán)色 暗紫 紫 紅褐 暗紅 紅 淺紅,,,,,,,,,,2、淀粉酸水解反應(yīng)動(dòng)力學(xué),,屬于單分子一級(jí)反應(yīng)類型：K：反應(yīng)速度常數(shù)，由反應(yīng)條件（如溫度、酸度等）而定C：淀粉濃度,,3、影響酸水解的因素 酸的種類主要因素

16、 濃度（酸的濃度、淀粉的濃度） 水解溫度,,,（二）、葡萄糖的復(fù)合反應(yīng)及其影響因素復(fù)合反應(yīng)：在淀粉的酸糖化過(guò)程中，水解生成的葡萄糖受酸和熱的影響，葡萄糖分子之間通過(guò)糖苷鍵相聚合，生成二糖、三糖及其他低聚糖。,,影響復(fù)合反應(yīng)的因素：1、淀粉濃度的影響（用DE值表示葡萄糖純度）：DE值＝還原糖/干物質(zhì)×100％2.、酸的影響：,（三）葡萄糖的分解反應(yīng)及其影響因素,葡萄糖

17、 5’-羥甲基糠醛 乙酰丙酸、蟻酸、有色素物質(zhì)；影響因素：濃度、溫度、pH值；,,,第三節(jié) 糖蜜前處理,一、糖蜜的來(lái)源與特點(diǎn)二、糖蜜前處理的方法1、加酸通風(fēng)沉淀法（冷酸通風(fēng)處理法）：糖蜜加水稀釋到500Bx 加入0.2～0.3％濃硫酸，通入壓縮空氣1h 靜置澄清8h，取上清液。,,,,2、加熱加酸沉淀法（熱酸通風(fēng)沉淀法）： 糖蜜加水稀釋到

18、40％ 加適量硫酸調(diào)節(jié)pH值到4～4.5 放入澄清槽加熱至80～90℃，通風(fēng)30min 保溫 70～80℃ 8～12 小時(shí)，取上清液。,,,,,,3、添加絮凝劑澄清處理法：糖蜜稀釋至30～40 Bx 加硫酸調(diào)pH 3～3.8 加熱至90℃ 添加8ppm聚丙烯酰胺（PAM），攪拌均勻 靜置1小時(shí)，取上清液。,

19、,,,,三、谷氨酸發(fā)酵糖蜜前處理,1.糖蜜預(yù)處理法活性炭處理法樹(shù)脂處理法亞硝酸處理法2.添加化學(xué)藥劑處理法添加青霉素法添加表面活性劑添加抗氧劑法3.追加糖蜜法4. 營(yíng)養(yǎng)缺陷型變異株法,第四節(jié) 其他原料的處理,一、纖維素及發(fā)酵廢液的處理（一）、利用纖維素廢料生產(chǎn)SCP稻草、麥稈、玉米的莖和葉、甘蔗渣、廢紙等流程如下：,,纖維原料,,粉碎,,,水解,,中和,澄清,,過(guò)濾,,發(fā)酵罐培養(yǎng),,分離,,廢液,,,,種子,營(yíng)養(yǎng)

20、鹽,菌體,濃縮,磨碎,干燥,,,,,成品,（二）利用檸檬酸中和濾液生產(chǎn)酵母,,酵母菌種,,斜面,,一級(jí)種子,,二級(jí)種子,,離心分離,,中和廢液,,鹽酸調(diào)pH3.5,發(fā)酵,,,,,干燥,,粉碎,,包裝,,二次廢液,,用于發(fā)酵培養(yǎng)基的配置等,,二、亞硫酸鹽廢液的處理（一）亞硫酸鹽制漿廢液生產(chǎn)酒精和蛋白質(zhì)1、亞硫酸鹽紙漿廢液生產(chǎn)酒精2、亞硫酸鹽紙漿廢液發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì)3、亞硫酸銨法非木材制漿廢液培養(yǎng)SCP （二）亞硫酸鹽廢液發(fā)酵

21、生產(chǎn)乳酸三、木屑水解液發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸,第五節(jié) 培養(yǎng)基滅菌,一、消毒與滅菌在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用消毒：指用物理和化學(xué)方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病源微生物。一般只能殺死營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞而不能殺死細(xì)菌芽孢。滅菌：用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢和孢子。消滅雜菌和防止雜菌污染,,二、滅菌方法：干熱滅菌、濕熱滅菌、物理滅菌（射線、微波等）、化學(xué)滅菌（各種化學(xué)藥品）；1、干熱滅菌法 灼燒滅菌、在

22、電熱或紅外線在設(shè)備內(nèi)加熱 主要用于保持干燥的物料、器具等,,2、濕熱滅菌法 借助蒸汽釋放的熱使微生物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、酶和核酸分子內(nèi)部的化學(xué)鍵，特別是氫鍵受到破壞，引起不可逆的變性，使微生物死亡。優(yōu)點(diǎn)：1）蒸汽來(lái)源容易，操作費(fèi)用低廉，本身無(wú)毒 2)蒸汽具有很強(qiáng)的穿透力，滅菌易于徹底 3）蒸汽均有很大的潛熱，冷凝后的水分有利于濕熱滅菌 4）蒸汽輸送可借助本身的壓強(qiáng)，調(diào)節(jié)方便，技術(shù)管理容易缺點(diǎn)：

23、1)設(shè)備費(fèi)用高 2）不能用于怕受潮的物料滅菌,,3、射線滅菌 紫外線、高速電子流的陰極射線、X射線和Y射線化學(xué)藥品滅菌法（1）第一大類：表面消毒劑高錳酸鉀溶液：0.1～0.25%、漂白粉 、75％的酒精、新潔爾滅和杜滅芬、甲醛 37％、戊二醛、過(guò)氧乙酸、焦碳酸二乙酯、酚類,,（2）第二大類：抗代謝藥物 化學(xué)結(jié)構(gòu)與微生物必須的代謝物類似 例如：磺胺類化合物取代氨基苯甲酸（3）第三大類：抗生素,

24、三、加熱滅菌的原理,1.、微生物的熱阻：微生物對(duì)熱的抵抗力； 致死溫度、致死時(shí)間2、微生物的熱致死動(dòng)力學(xué)：對(duì)數(shù)殘留定律,,一級(jí)反應(yīng)： 用N表示殘留活菌個(gè)數(shù)，則活菌的減少率（死亡率），與N呈線性關(guān)系，即：式中，K是反應(yīng)速度常數(shù)，對(duì)滅菌來(lái)講，是活菌的比熱致死速率常數(shù)，單位是min-1 ，其值與菌的種類和加熱溫度有關(guān)，需通過(guò)實(shí)驗(yàn)才能測(cè)定。,,,積分邊界條件：N0→Nθ；t0=0,式中，θ 滅菌時(shí)間（s）；N0

25、 滅菌開(kāi)始時(shí)，培養(yǎng)基中雜菌個(gè)數(shù)（個(gè)）；Nθ 經(jīng)過(guò)滅菌時(shí)間θ后，殘存的活菌數(shù)（個(gè)）。,,,3、熱致死反應(yīng)的速度常數(shù)K K是表達(dá)微生物耐熱性的特征常數(shù) ，與微生物的種類和滅菌溫度有關(guān)。K越小，微生物越耐熱,,,,,4、滅菌溫度的選擇式中 ΔE為菌體死滅反應(yīng)的活化能（J/mol），它是菌體死滅反應(yīng)的特征常數(shù)，所以，不同菌其熱死滅反應(yīng)的ΔE不同。,,,,四、影響培養(yǎng)基滅菌的其他因素,培養(yǎng)基成分、pH值、培養(yǎng)基中的顆粒、泡

26、沫,五、分批滅菌與連續(xù)滅菌,一）、分批滅菌的操作過(guò)程（實(shí)罐滅菌）1）培養(yǎng)基的預(yù)熱培養(yǎng)基先加熱到80－90℃，然后再導(dǎo)入蒸汽升溫到120－180℃。目的：1）防止直接導(dǎo)入蒸汽時(shí)由于培養(yǎng)基與蒸汽的溫度過(guò)大而產(chǎn)生大量的冷凝水使培養(yǎng)基稀釋 2）防止直接導(dǎo)入蒸汽所造成的泡沫急劇上升而引起的物料外溢。方法：先將排氣閥打開(kāi),,2）培養(yǎng)基滅菌 從各路通入蒸汽（進(jìn)氣口、排料口、取樣口），溫度升到120－130℃，保溫30min,,

27、2、分批滅菌的注意事項(xiàng)1）各路蒸汽進(jìn)口要暢通，防止短路逆流；罐內(nèi)液體翻動(dòng)要?jiǎng)×遥允构迌?nèi)物料達(dá)到均一的滅菌溫度。2）排氣量不宜過(guò)大，以節(jié)約蒸汽3）滅菌將要結(jié)束時(shí)，應(yīng)立即引入無(wú)菌空氣以保持罐壓，然后開(kāi)夾套或蛇管冷卻，以避免罐壓迅速下降產(chǎn)生負(fù)壓而吸入外界空氣，或引起發(fā)酵罐破壞。4）在引入無(wú)菌空氣前，罐內(nèi)壓力必須低于過(guò)濾器壓力，否則培養(yǎng)基將倒流入過(guò)濾器。,,（二）、連續(xù)滅菌： 1、連續(xù)滅菌優(yōu)點(diǎn)：1）可以采用高溫短時(shí)滅菌；2）發(fā)酵

28、罐利用率高；3）蒸汽負(fù)荷均衡；4）熱效率高；5）可采用自動(dòng)控制，降低勞動(dòng)強(qiáng)度；,2、連續(xù)滅菌流程,,,,,,,六、培養(yǎng)基與設(shè)備、管道滅菌條件 1、滅菌鍋內(nèi)滅菌2、種子培養(yǎng)基實(shí)罐滅菌3、發(fā)酵培養(yǎng)基實(shí)罐滅菌4、發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)滅菌5、消泡劑滅菌6、補(bǔ)料實(shí)罐滅菌7、尿素溶液滅菌,,作業(yè)：1、微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源主要包括哪些物質(zhì) 。2、簡(jiǎn)述發(fā)酵工業(yè)常用的滅菌方法。3、試畫(huà)出兩種不同的培養(yǎng)基連續(xù)滅菌流程圖。 4、