人甲母質(zhì)細(xì)胞無血清原代培養(yǎng)體系建立.pdf

1、20甲營養(yǎng)不良是一種發(fā)生在甲的特發(fā)性疾病，可伴隨或不伴隨其他疾病的難治性甲病，最初認(rèn)為該病主要出現(xiàn)在兒童中，后期研究發(fā)現(xiàn)，本病亦可在青年和成人起病。本病病因尚不明確，臨床表現(xiàn)為20個甲均變薄，甲板表面縱嵴、縱溝交替出現(xiàn)，失去光澤，粗糙不平，尤如被砂皮紙搽過，甲質(zhì)易碎裂，甲游離緣出現(xiàn)分離，甲板顏色呈灰白至灰黃色。常見伴隨疾病有扁平苔蘚、斑禿、濕疹、白癜風(fēng)、銀屑病等。20甲營養(yǎng)不良會影響患者的美觀及社交活動，且易形成甲溝炎，大部分患者有強烈

2、的就醫(yī)意愿。目前關(guān)于20甲營養(yǎng)不良的病因及發(fā)病機制不清，檢索文獻發(fā)現(xiàn)，甲板的形態(tài)受甲母質(zhì)細(xì)胞的生長及調(diào)控通路影響，如Wnt、Notch、BMP信號通路等，但關(guān)于甲母質(zhì)細(xì)胞的報道極少，且甲營養(yǎng)不良的研究大多是集中在組織水平或僅局限于動物實驗階段。甲營養(yǎng)不良發(fā)病發(fā)病機制的研究主要受限于不能獲得體外培養(yǎng)的人原代甲母質(zhì)細(xì)胞。因此，通過建立起人甲母質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，是進一步從細(xì)胞分子化學(xué)的水平研究甲營養(yǎng)不良的病因及發(fā)病機制的先決條件和基礎(chǔ)，更能

3、為探索甲營養(yǎng)不良的治療提供理論基礎(chǔ)。
　　本研究主要是通過收取甲母質(zhì)組織，建立起人甲母質(zhì)細(xì)胞無血清原代培養(yǎng)體系，為進一步從細(xì)胞分子化學(xué)的水平研究甲營養(yǎng)不良的可能病因及發(fā)病機制提供條件和基礎(chǔ)。
　　方法：
　　收集2016年1月至2016年12月在北京大學(xué)深圳醫(yī)院就診的要求行甲床修整術(shù)或多指（趾）畸形要求行截指（趾）術(shù)的患者，通過以上病例，獲取人甲母質(zhì)組織。將甲母質(zhì)組織塊去除多余的皮膚和皮下組織后，切成10～12塊小組織

4、塊，置于60mm塑料培養(yǎng)皿，待組織塊貼壁牢固后，加入無血清DEME/F-12培養(yǎng)基，放置在5％CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行組織塊培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第2～3天后，組織塊周圍有細(xì)胞爬出，5～7天后，在確認(rèn)細(xì)胞生長良好的前提下，將培養(yǎng)基改為無血清角質(zhì)形成細(xì)胞生長培養(yǎng)基（CnT-07培養(yǎng)基），繼續(xù)培養(yǎng)。將所得的原代培養(yǎng)細(xì)胞進行傳代培養(yǎng)、凍存、形態(tài)學(xué)觀察、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)術(shù)及流式細(xì)胞術(shù)等，對細(xì)胞進行鑒別，并利用免疫磁珠分選技術(shù)對細(xì)胞分離純化

5、。結(jié)果：
　　1、采用無血清DEME/F-12的組織塊培養(yǎng)法，在適宜培養(yǎng)條件下，組織塊貼壁后的第2-3天有細(xì)胞爬出，改用無血清角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基CnT-07培養(yǎng)基后，細(xì)胞仍可進一步生長、繁殖；
　　2、組織塊培養(yǎng)法及傳代培養(yǎng)所得的大部分細(xì)胞為上皮樣細(xì)胞，呈鋪路石樣排列，部分細(xì)胞可呈紡綞形或星形，細(xì)胞每2～3周需傳代一次，所得細(xì)胞可進行凍存、復(fù)蘇及再培養(yǎng)；
　　3、采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)術(shù)可發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的細(xì)胞，有部分細(xì)胞

6、仍可表達角蛋白5及角蛋白10；
　　4、將該方法培養(yǎng)所得的第二代細(xì)胞進行流式細(xì)胞術(shù)分析，結(jié)果顯示，培養(yǎng)的細(xì)胞中含有雜質(zhì)細(xì)胞，甲母質(zhì)細(xì)胞的純度約為37.6%；
　　結(jié)論：
　　1、采用組織塊培養(yǎng)法結(jié)合無血清培養(yǎng)基可以成功培養(yǎng)出人原代甲母質(zhì)細(xì)胞，所得的細(xì)胞可繼續(xù)進行傳代培養(yǎng)、凍存及復(fù)蘇培養(yǎng)；
　　2、體外培養(yǎng)的人甲母質(zhì)細(xì)胞可表達角蛋白5和角蛋白10；
　　3、組織塊培養(yǎng)法所得的細(xì)胞純度約37.6%，成纖維細(xì)胞是