大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及永生化研究.pdf

1、Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜中主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。以往人們認(rèn)為，Müller細(xì)胞通過發(fā)出分支包圍、分隔神經(jīng)元的胞體和突起而對神經(jīng)元起支持和營養(yǎng)作用。近來研究表明Müller細(xì)胞還具有維持細(xì)胞外微環(huán)境平衡和調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞活動等作用。在外傷性增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變等眼病中，Müller細(xì)胞通過表達(dá)一些生長因子與該疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。該細(xì)胞在視網(wǎng)膜中的作用正日益受到人們的重視。但由于原代培養(yǎng)的視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞傳代次數(shù)有限，制約了進(jìn)一步的研究。

2、 細(xì)胞永生化最常用的方法是基因轉(zhuǎn)染，SV40 Tag基因是較為常用的體外永生化目的基因片段之一。猴病毒40(simianvirus40，sv40)為雙股環(huán)狀。DNA病毒，是1960年在用猴腎細(xì)胞培養(yǎng)制備脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗過程中發(fā)現(xiàn)的，它由結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3)和SV40早期轉(zhuǎn)錄區(qū)基因編碼的大T和小t抗原組成。大T抗原為細(xì)胞轉(zhuǎn)化啟動所必需，而且轉(zhuǎn)化細(xì)胞表型的維持必須有大T抗原的連續(xù)表達(dá)。 本研究以酶消化法原代培

3、養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞，采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法將大T抗原轉(zhuǎn)染入其中，擬建立永生化視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞系，并對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在動物眼玻璃體腔內(nèi)生長進(jìn)行了觀察。大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞系的建立將為進(jìn)一步研究增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)、糖尿病玻璃體視網(wǎng)膜病變(PDR)等提供理想的細(xì)胞來源。 一研究目的： 利用酶消化法原代培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞，以SV40大T抗原(SV40LT)轉(zhuǎn)染之，擬建立永生化大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞系，并對其生物學(xué)性

4、狀進(jìn)行研究。 二實(shí)驗(yàn)方法： 1、酶消化法體外原代培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞，相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT比色法繪制細(xì)胞生長曲線，免疫組織化學(xué)對細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 2、通過Lipofeetomin2000轉(zhuǎn)染攜帶SV40LT抗原的質(zhì)粒進(jìn)入第三代原代培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞，潮霉素篩選并傳代；相差顯微鏡和MTT比色法觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長及增殖情況；免疫組織化學(xué)和RT-PCR檢測永生化大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞SV40大T抗原、GFA

5、P、VIM表達(dá)。 3、將轉(zhuǎn)染SV40LT抗原后的膠質(zhì)細(xì)胞注射入大鼠玻璃體腔，HE染色觀察其在眼內(nèi)生長情況，免疫組織化學(xué)鑒定細(xì)胞成分。 三．實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、利用酶消化法成功原代培養(yǎng)出大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞。視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)貼壁生長，細(xì)胞呈星形、不規(guī)則形，消化后的細(xì)胞呈圓或橢圓形。傳至第三代時(shí)，經(jīng)免疫組化鑒定，Müller細(xì)胞已占98％以上。傳代至第10代，出現(xiàn)細(xì)胞生長緩慢甚至停滯，傳代后不生長。 2、轉(zhuǎn)染SV

6、40大T抗原后的視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞生長旺盛，可反復(fù)傳代，目前已達(dá)30代。倒置顯微鏡下，細(xì)胞為單層貼壁生長，形態(tài)呈多角形、啞鈴形等典型的膠質(zhì)細(xì)胞樣特征。免疫組化染色GFAP，VIM，SV40LT呈陽性表達(dá)。RT—PCR擴(kuò)增檢測GFAP，VIM，SV40LT出現(xiàn)陽性條帶。 3、轉(zhuǎn)染后的視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞注入大鼠玻璃體腔，能生長存活，位于晶狀體后視網(wǎng)膜前，呈膜樣。免疫組化鑒定顯示構(gòu)成該膜的細(xì)胞以GFAP、VIM陽性細(xì)胞為主。 四結(jié)論：