細(xì)胞的原代培養(yǎng)原理

1、細(xì)胞的原代培養(yǎng)(Cell primary culture),實(shí)驗(yàn) 十一,背景資料,原代培養(yǎng)(primary culture)：從生物體取材進(jìn)行培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物、不更換培養(yǎng)物的生長(zhǎng)器皿。細(xì)胞的生長(zhǎng)條件：① 無(wú)菌 ② 溫度 ③ pH ④ 滲透壓⑤ 氧氣 ⑥ 營(yíng)養(yǎng)及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子,背景資料,培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)類型,貼附型,成纖維細(xì)胞型細(xì)胞,上皮型細(xì)胞,游走型細(xì)胞,多形型細(xì)胞,懸浮型,,,1、成纖維細(xì)胞型： 胞體呈梭型

2、或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形 核，胞質(zhì)突起，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀。 除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起 源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管 內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。 培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類似時(shí)皆可稱之為 成纖維細(xì)胞。,背景資料,2、上皮型細(xì)胞： 細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì) 胞彼此緊密相連成單層膜。生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)， 處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連，很少單獨(dú)行動(dòng)。 起源于內(nèi)、外胚

3、層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生 物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮 型形態(tài)。,背景資料,3、游走細(xì)胞型：呈散在生長(zhǎng)，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。4、多型細(xì)胞型：有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，統(tǒng)歸于此類。,背景資料,懸浮型： 胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長(zhǎng)。這 類細(xì)胞容易大量繁殖。 見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌

4、細(xì)胞及 白血病細(xì)胞。,背景資料,原代細(xì)胞培養(yǎng)的一般方法: 植塊培養(yǎng)法(explant culture) 分離(散)細(xì)胞培養(yǎng)法 (dissociated cell culture),背景資料,一、心肌細(xì)胞、表皮細(xì)胞的培養(yǎng)二、淋巴細(xì)胞的培養(yǎng),心肌細(xì)胞、表皮細(xì)胞的原代培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解細(xì)胞體外培養(yǎng)的原理、基本方 法，掌握無(wú)菌操作方法及注意事項(xiàng)。 學(xué)習(xí)觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng) 狀況。,實(shí)驗(yàn)原理,來(lái)自機(jī)體的細(xì)胞、組

5、織、器官； 類似體內(nèi)的體外環(huán)境； 人工培養(yǎng)條件下生存、生長(zhǎng)、繁殖。,主要儀器：純水儀；離心機(jī)；CO2培養(yǎng)箱；電熱干燥箱；高壓蒸汽消毒鍋；過(guò)濾器及0.22 ?m濾膜； 超凈臺(tái)；眼科剪、鑷；培養(yǎng)瓶；青霉素瓶；平皿；吸管；移液管；血球計(jì)數(shù)板,實(shí)驗(yàn)用品,實(shí)驗(yàn)用品,實(shí)驗(yàn)材料： 7－12日齡的雞胚,實(shí)驗(yàn)用品,實(shí)驗(yàn)試劑：（1） M199 培養(yǎng)液（2）  小牛血清（3）  青、鏈霉素（4 ） Hank’s

6、液（5）  5％NaHCO3（6）  2％碘酒（7） 75％酒精,實(shí)驗(yàn)步驟,一、培養(yǎng)前的準(zhǔn)備工作 （1）  清洗與消毒（2）  配制溶液（3）  預(yù)熱溶液（4）  紫外線消毒（5） 洗手和著裝（6） 進(jìn)入無(wú)菌室,實(shí)驗(yàn)步驟,二、植塊培養(yǎng)法培養(yǎng)雞心肌細(xì)胞（1）  配培養(yǎng)液： 含抗生素的M199基礎(chǔ)培養(yǎng)液 9 ml

7、 小牛血清 1 ml 過(guò)濾除菌。,實(shí)驗(yàn)步驟,（2）  獲取心臟： ① 消毒雞蛋 ② 取出雞胚，Hank’s液洗滌。 ③ 取出心臟，Hank’s液清洗。,實(shí)驗(yàn)步驟,（3） 處理心臟 ① 漂洗心臟，剪成約1 mm3大小的小塊。 ② 將組織塊排放在培養(yǎng)皿中，貼

8、壁 ③ 培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)步驟,三、植塊培養(yǎng)法培養(yǎng)雞表皮細(xì)胞 從雞胚體表撕取表皮，剪成組織塊進(jìn)行培養(yǎng)。具體實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程與心肌細(xì)胞的培養(yǎng)相同。,? 嚴(yán)格無(wú)菌操作。 ? 植塊培養(yǎng)時(shí)注意黏附，加液量不 可過(guò)多或過(guò)少，過(guò)多，會(huì)漂浮； 過(guò)少，會(huì)干死。,注意事項(xiàng),四、觀察培養(yǎng)結(jié)果 培養(yǎng)2－3天，細(xì)胞從植塊向外遷移，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，在植塊周圍形成一圈細(xì)胞——“暈”，稱之為生長(zhǎng)暈(growth hallow)。

9、,實(shí)驗(yàn)步驟,淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)(Lymphocyte culture),實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)方法 細(xì)胞活力檢查 懸浮細(xì)胞的形態(tài)特征觀察,實(shí)驗(yàn)原理,,外周血淋巴細(xì)胞表面具有有絲分裂原受體，當(dāng)在培養(yǎng)液中加入有絲分裂原PHA時(shí)，可與淋巴細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合使其激活，從而促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。,主要儀器：純水儀、離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱、電熱干燥箱、高壓蒸汽消毒鍋、過(guò)濾器及0.22 ?m濾膜、 超凈臺(tái)、培養(yǎng)瓶、離心管、吸管、移液管、血

10、球計(jì)數(shù)板、一次性注射器,實(shí)驗(yàn)用品,實(shí)驗(yàn)用品,實(shí)驗(yàn)材料：  （肝素）抗凝血注射器中吸入0.1 ml 180 IU／ml肝素鈉溶液，雞翅下靜脈采血5 ml。,實(shí)驗(yàn)試劑： （1）RPMI 1640 培養(yǎng)液 （3）肝素鈉（180 IU／ml） （5） PHA（2 mg/ml） （7） 5％NaHCO3

11、 （9）  2％碘酒棉球（11） 1%臺(tái)盼藍(lán),實(shí)驗(yàn)用品,（2）  小牛血清（4）  青、鏈霉素（6）  Hank’s液（8）  1N 鹽酸（10） 75％酒精棉球,實(shí)驗(yàn)步驟,（1） 配培養(yǎng)液： RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液 80％ 小牛血清

12、 20％ 肝素（180 IU／ml） 3.6 IU/ml PHA（2 mg/ ml） 40 ?g/ml 青、鏈霉素 100 IU/ml 100 ?g/ml 調(diào)pH至6.

13、8－7.2，0.22 ?m濾膜過(guò)濾除菌。,實(shí)驗(yàn)步驟,（2）采血：肝素抗凝，靜脈采血。（3）分離淋巴細(xì)胞 （4）洗滌淋巴細(xì)胞 （5）細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞活力檢查（6）稀釋培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)步驟,（7）  結(jié)果：培養(yǎng)3天后觀察結(jié)果。   細(xì)胞計(jì)數(shù)：淋巴細(xì)胞增殖情況。,注意事項(xiàng),過(guò)濾消毒淋巴細(xì)胞的分離洗滌：Hank’s 液、RPMI 1640培養(yǎng)液4 ml