兔角膜緣干細胞原代培養(yǎng)優(yōu)化方法的初步探索.pdf

1、目的：
　　取新西蘭大白兔的眼角膜緣組織，用DispaseⅡ與胰酶-EDTA分別在4℃與37℃冷熱交替條件下進行消化，進而分離獲取兔的角膜緣干細胞進行體外培養(yǎng)。與常規(guī)的單獨使用DispaseⅡ在37℃條件下分離獲取的兔角膜緣干細胞進行體外培養(yǎng)的方法進行比較。通過對兩種不同消化方法分離獲取的兔角膜緣干細胞的生物學特性的研究，探索兔角膜緣干細胞原代培養(yǎng)的優(yōu)化方法，為眼表組織工程學的臨床研究奠定更好的實驗基礎(chǔ)。
　　方法：

2、　　無菌操作下剪取兔的角膜緣組織，分為優(yōu)化組和常規(guī)組。優(yōu)化組的角膜緣組織分別在DispaseⅡ中4℃與胰酶-EDTA中37℃冷熱交替條件下進行消化，常規(guī)組的角膜緣組織在DispaseⅡ中37℃條件下消化，獲取角膜緣干細胞，然后制成單細胞懸液，兩組都用含10％胎牛血清的KSFM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。通過以下3種方法進行對比：1、將單細胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，用倒置顯微鏡觀察細胞的生長和形態(tài)特征；2、細胞傳代后接種于24孔板中，進行免疫熒光染色，從

3、而對細胞進行免疫學鑒定；3、細胞傳代于6孔板上，進行結(jié)晶紫染色檢測其細胞增殖能力，判斷其干細胞增殖的特性。
　　結(jié)果：
　　在倒置顯微鏡下觀察到優(yōu)化組與常規(guī)組培養(yǎng)的兔角膜緣干細胞表現(xiàn)出相似的一般生長特性；細胞免疫熒光染色顯示，優(yōu)化組與常規(guī)組均表現(xiàn)為多量的ΔNp63染色，呈胞核綠染；少量的K3染色，胞質(zhì)呈現(xiàn)的是紅色染色。優(yōu)化組與常規(guī)組相比較，優(yōu)化組的ΔNp63陽性細胞較多（P<0.05），而角蛋白K3陽性細胞則較少（P<0.0