牛磺酸對原代培養(yǎng)大鼠肝細胞的毒性作用研究.pdf

1、目的：探索使用兩步灌流法分離培養(yǎng)原代正常大鼠肝細胞的條件和方法，研究?；撬釋υ囵B(yǎng)的正常大鼠肝細胞的毒性作用，以利用體外肝細胞模型建立藥物肝毒性評價體系進行探索。 方法：(1)原代肝實質細胞使用經典的“兩步門靜脈膠原酶灌注分離法”進行分離，接種后貼壁培養(yǎng)，觀察記錄細胞生長狀況，觀察指標包括：臺盼蘭拒染法測定細胞活率、繪制細胞生長曲線。(2)牛磺酸對原代大鼠肝細胞毒性作用實驗，包括直接加藥法：測定藥物的IC50，MTT比色實驗測

2、藥物對細胞的生長抑制率，藥物作用24h后測定培養(yǎng)液上清的AST、ALT、LDH、GSH、細胞內GSH的濃度，免疫組化TUNEL法測定細胞凋亡率(AI)；含藥血清法：MTT法測定含5％、10％、15％、20％含藥血清的培養(yǎng)液對細胞的生長抑制率的影響。(3)動物實驗部分：?；撬犰o脈大劑量注射對大鼠肝、脾臟器系數的影響、對肝脾的病理改變，血清中AST、ALT、LDH、GSH及10％肝勻漿GSH的含量影響。 結果：(1)兩步門靜脈膠原酶

3、灌注分離取得的肝細胞活率＞70％，24h內貼壁，生長良好，從生長曲線可看出培養(yǎng)第3天進入對數生長期；(2)直接加藥法測得?；撬酙C50為24.23mg/ml，MTT實驗中細胞生長抑制率與劑量有正相關性，TUNEL實驗細胞凋亡率測定，3個給藥組AI分別為：3.71％、29.72％、42.56％。培養(yǎng)液上清AST、ALT顯著升高，LDH含量上升，培養(yǎng)液上清和細胞內GSH含量均減少；含5％、10％、15％、20％含藥血清的培養(yǎng)液對細胞的生長抑

4、制率明顯比直接加藥法??；(3)體內實驗中，動物肝、脾明顯腫大，但病理切片顯示肝脾結構和細胞損傷小，血清AST、ALT含量無明顯變化，?；撬岽髣┝拷M血清LDH含量有顯著降低，血清GSH，細胞內GSH含量略有降低，但無顯著差異。 結論：兩步門靜脈膠原酶灌注分離法是個產量高，損傷小，細胞純度高的分離原代正常大鼠肝細胞的方法；直接加藥法實驗中高濃度的?；撬釋w外培養(yǎng)肝細胞有一定損傷，但血清藥理學實驗中?；撬釋毎膿p傷較直接加藥法??；動