原代培養(yǎng)大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞液壓沖擊損傷后蛋白差異性表達(dá)的研究.pdf

1、目的：建立原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞液壓沖擊損傷模型，利用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)觀察腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞液壓沖擊損傷后蛋白質(zhì)組的表達(dá)變化，探尋腦損傷的特異性生物標(biāo)志蛋白。 方法：取出生后24h內(nèi)SD大鼠(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)大腦皮質(zhì)組織，于含有10％胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞體外分離培養(yǎng)和純化，并以膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行純度鑒定。隨機(jī)將細(xì)胞分為對(duì)照組和損傷后4h、8h、12h、

2、24h、48h組，復(fù)制Scott's細(xì)胞液壓沖擊損傷模型(0.2MPa)。用臺(tái)盼藍(lán)染色觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷前后形態(tài)學(xué)變化，測(cè)培養(yǎng)液中LDH活力反映細(xì)胞的損傷程度，PI/Hoechst33342染色進(jìn)行凋亡分析。提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)雙向電泳和MALDL-TOF質(zhì)譜分析鑒定差異蛋白質(zhì)。 結(jié)果： 1.星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)和純化：經(jīng)2-3次搖床傳代純化培養(yǎng)后的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)均一，胞體較大而扁、胞質(zhì)較豐富、形狀不規(guī)則；胞突豐富、分

3、支多呈放射狀，一級(jí)胞突較粗，常有二級(jí)分支；胞核圓形或橢圓形，常偏于胞體一側(cè)。培養(yǎng)至24-26d，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，鋪滿(mǎn)皿底，形成大致均一的扁平細(xì)胞層。 2.星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度鑒定：采用GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色(SP法)，計(jì)數(shù)結(jié)果顯示培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞純度可達(dá)94.9％±1.9％。 3.液壓沖擊損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變：光鏡下觀察，細(xì)胞隨時(shí)間發(fā)生間隙增大、腫脹、變圓、恢復(fù)，部分細(xì)胞發(fā)生皺縮、胞膜破裂、脫壁等顯著的形態(tài)

4、學(xué)改變；PI/Hoechst33342(1:1)熒光雙染可見(jiàn)凋亡細(xì)胞。 4液壓沖擊損傷后細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的變化：與正常對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液相比，損傷后各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力均降低，4h組降至最低，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。然后其它組逐漸上升，48h組與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 5 液壓沖擊損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞雙向電泳圖譜分析：雙向電泳圖譜經(jīng)PDquest軟件分析檢測(cè)到的各組總蛋白點(diǎn)數(shù)：對(duì)照

5、組1369±56，4h組1325±94，8h組1136±81，12h組1197±112，24h組1257±63，48h組1176±73。蛋白點(diǎn)多分布于pI5.2-6.6、MW30kDa-70kDa的范圍；以對(duì)照組為參考膠，平均圖譜匹配率達(dá)82％以上。損傷后共有265個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的相對(duì)強(qiáng)度與正常對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，其中38個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在損傷后表達(dá)升高，111個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在損傷后表達(dá)下降，45個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)為損傷后新表達(dá)，有71個(gè)

6、蛋白質(zhì)點(diǎn)在損傷后各組均未表達(dá)。 6 差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定：對(duì)9個(gè)差異蛋白點(diǎn)行MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定，其中8個(gè)點(diǎn)得分大于61分(P＜0.05)，分別為60S酸性核糖體蛋白P2(60S acidic ribosomal protein P2)、細(xì)胞視黃醇結(jié)合蛋白(cellular retinol binding protein，Crbp)、腦脂肪酸結(jié)合蛋白7(brain fatty acid binding protein 7，

7、FABP7)、S-100鈣結(jié)合蛋白A11(S100 calcium binding protein A11，S100A11)、假設(shè)蛋白LOC685814(hypothetical protein LOC685814)、真核生物翻譯起始因子1A(Eukaryotic translation initiation factor 1A，eIF-1A)、乳腺癌擴(kuò)增序列2同源體(Breast carcinoma amplified sequenc

8、e 2 homolog,BCAS2)、鈣結(jié)合蛋白3(calponin 3)。其中對(duì)FABP7行Western-blot驗(yàn)證，結(jié)果顯示：FABP7在星形膠質(zhì)細(xì)胞中存在表達(dá)，而且該蛋白在星形膠質(zhì)細(xì)胞液壓沖擊損傷后的變化趨勢(shì)與雙向電泳圖像經(jīng)PDQuest軟件分析后得到的蛋白質(zhì)變化趨勢(shì)相一致。 結(jié)論： 1.液壓沖擊損傷可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，且有一定的時(shí)間依從性。 2.液壓沖擊損傷能導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞蛋白質(zhì)組表達(dá)

9、發(fā)生變化，損傷后共有265個(gè)蛋白點(diǎn)的相對(duì)強(qiáng)度與正常對(duì)照組相比有顯著性差異，對(duì)其深入研究，有可能探尋到腦損傷的生物標(biāo)志蛋白。 3.經(jīng)MALDL-TOF質(zhì)譜分析初步確定的8種蛋白大致分為代謝調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)、翻譯起始相關(guān)類(lèi)及其它等四類(lèi)，這些蛋白表達(dá)的變化表明它們?cè)趨⑴c星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后早期反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞功能恢復(fù)、抑制細(xì)胞繼發(fā)性損傷、參與細(xì)胞骨架組織重組及改善蛋白質(zhì)合成等環(huán)節(jié)起重要作用，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究，有望深入了解腦損傷的分子機(jī)