多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑的研究.pdf

1、近年來惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率一直呈明顯上升趨勢,用于惡性腫瘤治療的方法主要包括放射治療、手術(shù)治療和藥物治療,其中對于實體瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤的治療,藥物治療占有重要地位,特別是腫瘤化療取得了很大程度上的進步。多西他賽是目前廣泛研究應用的一種新型紫杉烷類抗腫瘤藥物,其作用機制是通過刺激導管素的聚合,加強微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用,導致形成穩(wěn)定的非功能性微管束,因而破壞腫瘤細胞的有絲分裂。多西他賽在臨床上被廣泛地應用于卵巢癌、乳腺癌、非小

2、細胞肺癌和其它多種癌癥的治療。但多西他賽由于溶解度差、生物利用度低及毒性大等使其臨床應用受到限制,目前臨床應用的劑型僅為注射液,泰索帝(R)和多帕菲(R),該注射劑含有大量非離子表面活性劑Tween-80。其中藥物本身或吐溫-80會引起嚴重的過敏反應如過敏反應,體液潴留,神經(jīng)、骨骼肌肉毒性和中性粒細胞減少癥等,限制了其臨床應用。因此,研究、探索新型高效、低毒藥物給藥系統(tǒng)成為藥劑學研究熱點之一。
　　本課題旨在研發(fā)新的給藥系統(tǒng)提高多

3、西他賽的水溶性,避免吐溫-80表面活性劑的使用,同時選擇合適的腫瘤靶向因子將抗癌藥物專一性或選擇性的輸送到腫瘤組織,減少藥物在正常組織器官的分布,降低其對正常組織器官的毒副作用,利于未來用于癌癥的治療。
　　本研究課題首次制備三種不同類型的可生物降解的脂質(zhì)納米混懸劑:一、被動靶向多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑(DTX-lipid-based-docetaxel-nanosuspensions,DTX-LNS);二、長循環(huán)多西他賽脂質(zhì)納米混

4、懸劑(pLNS);三、葉酸介導的主動靶向多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑(tLNS)。本課題對這三種多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑進行了系統(tǒng)的理化性質(zhì)研究、藥效學評價,以及體內(nèi)藥代動力學行為和體內(nèi)組織分布行為研究,研究內(nèi)容與結(jié)果如下:
　　一、多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑藥物含量測定方法的建立
　　采用高效液相色譜法測定多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑中多西他賽的含量,并對方法學進行了研究。結(jié)果表明此方法簡便快速、靈敏度高、專屬性強,能準確測定多西他賽的含量

5、。
　　二、被動靶向多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑的研究
　　采用高壓均質(zhì)法制備DTX-LNS,采用冷凍干燥法以甘露醇作為凍干保護劑制備DTX-LNS凍干制劑。使用透射電鏡觀察粒子外觀形態(tài),ZETASIZER3000激光粒度分布與電勢分析儀考察其粒徑、粒徑分布。采用透析袋法考察其體外釋藥行為。腫瘤細胞毒性研究中,以多西他賽市售注射液多帕菲(R)為對照組,采用噻唑藍比色法(MTT法)測定多帕菲(R)、DTX-LNS和Blank-LNS

6、對卵巢癌細胞株(SK-OV-3)和小鼠黑色素瘤細胞株(B16)的細胞毒性作用。藥效學研究中,進行了DTX-LNS與市售多帕菲啦射液對荷小鼠黑色素瘤(B16)昆明鼠的體內(nèi)抗腫瘤效果的比較。試驗結(jié)果顯示在優(yōu)化條件下采用高壓均質(zhì)法制備DTX-LNS,制得的納米混懸劑粒子形態(tài)規(guī)整,平均粒徑為200.0±3.42 nm,zeta電位為-11.15±0.99 mV,穩(wěn)定性好。多帕菲(R)與DTX-LNS體外釋藥均符合一級動力學數(shù)學模型,釋放曲線擬合

7、方程分別為:DTX-LNS:1n(100-Q)=-0.1961 t+4.5543,r=0.9946,多帕菲(R):1n(100-Q)=-0.1859 t+4.4038,r=0.9991.。多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑的細胞毒性與多帕菲@注射液的細胞毒性相當。體內(nèi)藥效學研究結(jié)果表明,與多帕菲(R),LNS作為抗腫瘤藥物載體可通過被動靶向作用,使藥物蓄積于腫瘤部位,增強藥物的抗腫瘤作用同時降低藥物對正常組織的毒副作用。采用高壓勻質(zhì)發(fā)制備的DTX-

8、LNS,可進行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),粒徑小,體內(nèi)抑瘤效果好,毒性低,是一種具有開發(fā)上市潛力的藥物新劑型。
　　三、長循環(huán)和主動靶向多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑的研究
　　采用高壓均質(zhì)法以PEG修飾的脂質(zhì)載體材料制得表面有PEG修飾的長循環(huán)脂質(zhì)納米混懸劑(pLNs)。利用葉酸上的羧基與DSPE-PEG上的氨基通過DCC反應制得DSPE-PEG-FA,將DSPE-PEG-FA摻入脂質(zhì)載體材料中成功制備主動靶向脂質(zhì)納米混懸劑(tLNS)。使用透射

9、電鏡觀察粒子外觀形態(tài),ZETASIZER3000激光粒度分布與電勢分析儀考察其粒徑、粒徑分布。采用透析袋法考察其體外釋藥行為。腫瘤細胞毒性研究中,采用噻唑藍比色法(MTT法)研究多帕菲(R)、pLNs、tLNS、Blank-pLNS和Blank-tLNS對細胞表面低表達葉酸受體的腫瘤細胞人肝癌細胞株(HepG2)和細胞表面高表達葉酸受體的腫瘤細胞小鼠黑色素瘤細胞株(B16)的細胞毒性作用。藥效學研究中,進行了pLNS、tLNs與市售多帕

10、菲(R)注射液對荷小鼠黑色素瘤(B16)昆明鼠的體內(nèi)抗腫瘤效果的比較。藥物代謝與組織分布研究中,比較pLNS、tLNS與市售多帕菲(R)在荷小鼠黑色素瘤(B16)昆明鼠中的分布,并進行靶向性評價。
　　本部分制得的pLNS、tLNS的平均粒徑分別為204.2±6.18 nm、220.6±9.54 nm,zeta電位分別為-33.83±0.35 mV、-27.80±0.77mV。體外釋放均符合一級動力學數(shù)學模型。腫瘤細胞毒性試驗結(jié)果

11、表明,與多帕菲(R)相比,兩種脂質(zhì)納米混懸劑的抗腫瘤活性明顯增強。對于主動靶向制劑組,tLNS對B16細胞的IC50值明顯低于pLNS的IC50值(P＜0.05),而對于HepG2細胞的IC50值沒有顯著性差異,細胞毒性相當。結(jié)果說明,對于細胞表面高表達葉酸受體的腫瘤細胞,由于其表面大量的葉酸受體與連有葉酸的載體結(jié)合,使抗癌藥物可以更多的進入細胞內(nèi)部,發(fā)揮抑瘤作用,因此,體外抑瘤中,與pLNS相比,tLNS顯示出較強的抗腫瘤活性。藥效學

12、實驗結(jié)果表明,pLNS組與Duopafei(R)組相比具有明顯的抑瘤效果,tLNS組又有更好的治療效果。tLNS組與Duopafei(R)組比較,瘤體積減小明顯(P＜0.01),表明制劑組與多帕菲(R)注射液組相比療效更好。同時小鼠體重變化相差明顯(p＜0.01),N.S組、Blank-pLNS組、Blank-tLNS組、pLNS組和tLNS組,小鼠體重均有明顯增長,唯有注射液多帕菲(R)組小鼠體重下降。由于體重變化是判斷制劑毒性的一個

13、重要指標,因此上述結(jié)果說明各多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑的毒性作用遠小于市售注射液多帕菲,具有臨床用藥的價值。小鼠體內(nèi)藥代動力學試驗證明LNS、pIMS與tLNS脂質(zhì)納米混懸劑靜脈注射給藥后,均可延長藥物在小鼠體內(nèi)的滯留時間。對三種納米混懸劑的瘤內(nèi)靶向性進行評價,結(jié)果顯示,pLNS組瘤的總靶向效率Te由多帕菲(R)注射液組的5.22%提高到5.67%(1.09倍),其相對攝取率re和瘤內(nèi)峰濃度Ce分別為5.22和1.02;tLNS組瘤的總靶向

14、效率Te由多帕菲(R)注射液組5.22%提高到6.40%(1.23倍),是長循環(huán)脂質(zhì)納米混懸劑的1.13倍,其相對攝取率re和瘤內(nèi)峰濃度Ce分別為5.92和1.17。這些結(jié)果進一步說明了,與pLNS相比,多西他賽tLNS有更好的腫瘤靶向效率,可更明顯的抑制腫瘤生長。
　　綜上所述,本研究制備的三種多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑是一種多西他賽新劑型,制備工藝簡單可行,重現(xiàn)性好,適合產(chǎn)業(yè)化,改善了多西他賽的溶解度,增強了其抗腫瘤作用同時降低了