葉酸和可激活穿膜肽共同修飾的多西他賽納米脂質(zhì)載體抗腫瘤靶向研究.pdf

1、多西他賽,屬于紫杉烷類抗癌藥物,臨床對于乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、頭頸癌等癌癥具有顯著療效。市售注射制劑采用吐溫-80和乙醇做助溶劑,易產(chǎn)生溶血和過敏等不良反應(yīng),這些因素限制了多西他賽在臨床治療中的應(yīng)用。針對上述問題,本研究設(shè)計構(gòu)建一種可被腫瘤組織分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2/9所激活的細(xì)胞穿膜肽(activatable cell-penetrating peptide,ACPP)和葉酸雙重修飾的新型多西他賽納米脂質(zhì)載體,提高多西

2、他賽抗腫瘤效果,同時降低毒副作用。
　　首先,成功設(shè)計了兼具腫瘤組織靶向傳遞和細(xì)胞高效穿透功能的ACPP,該結(jié)構(gòu)分為三個部分:包括聚陽離子域(細(xì)胞穿膜肽部分)、底物肽域(MMP-2/9酶可裂解部分)、聚陰離子域(衰減肽部分)。采用HPLC法,對ACPP的酶解行為進(jìn)行研究。通過親核取代反應(yīng)和邁克爾加成反應(yīng)成功合成了 DSPE-PEG2000-ACPP、DSPE-PEG2000-CPP和DSPE-PEG5000-Folate。基質(zhì)輔助

3、激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)證實了產(chǎn)物的生成。
　　采用乳化-超聲法制備了PEG化的CPP,ACPP,ACPP和葉酸共同修飾的多西他賽納米脂質(zhì)載體。以香豆素-6作為體外細(xì)胞水平的示蹤劑,制備了包載香豆素-6的被動靶向和主動靶向的納米脂質(zhì)載體,進(jìn)行了制劑體外細(xì)胞水平的定性和定量研究。以羰花青熒光染料DiR為近紅外探針,制備了包載DiR的各組納米脂質(zhì)載體,用于活體成像實驗,研究給藥系統(tǒng)腫瘤靶向和組織分布情況。所

4、制備的納米脂質(zhì)粒徑為30-40 nm,PDI小于0.15,粒徑小且分布均一,包封率均在95％以上,4℃放置1個月內(nèi)穩(wěn)定性良好。差示掃描量熱法證明藥物被包裹在納米脂質(zhì)載體中,制劑的相對結(jié)晶度有所減低,內(nèi)部結(jié)構(gòu)中不規(guī)則的無定形態(tài)比例有所增加,體外釋放結(jié)果顯示,多西他賽納米脂質(zhì)載體具有明顯的緩釋特征。
　　選擇高表達(dá)葉酸受體的KB細(xì)胞,具有一定葉酸受體表達(dá)的MCF-7細(xì)胞,沒有葉酸受體表達(dá)的A549細(xì)胞以及過度分泌基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP

5、-2/9的HT-1080細(xì)胞作為模型,對PEG化的葉酸以及ACPP修飾的多西他賽納米脂質(zhì)載體的體外活性進(jìn)行評價。通過流式細(xì)胞儀考察葉酸和ACPP對納米脂質(zhì)載體細(xì)胞攝取能力的影響,通過激光共聚焦顯微鏡考察制劑在細(xì)胞內(nèi)的定位和分布,初步探討納米脂質(zhì)載體細(xì)胞內(nèi)化的機(jī)理。研究發(fā)現(xiàn),ACPP與葉酸共同介導(dǎo)可以顯著提高KB、MCF-7和HT-1080細(xì)胞對納米脂質(zhì)載體的攝取,攝取的程度受細(xì)胞表面葉酸受體的表達(dá)和MMPs分泌水平的影響。兩者對A549

6、細(xì)胞的攝取影響不大。在外加MMPs的情況下,ACPP和葉酸修飾的納米脂質(zhì)載體呈現(xiàn)最強(qiáng)的細(xì)胞靶向性和最高效的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)能力。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),進(jìn)入胞內(nèi)的雙修飾納米脂質(zhì)載體主要分布于細(xì)胞漿中。
　　對多西他賽納米脂質(zhì)載體進(jìn)行體外細(xì)胞毒性評價,包括:(1)MTT細(xì)胞毒實驗:葉酸和ACPP修飾的納米脂質(zhì)載體(F/ACPP-DTX-NLC)增強(qiáng)了多西他賽對KB細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞和HT-1080細(xì)胞的殺傷作用。(2)Annexixi

7、n V/PI細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)實驗:主動靶向的多西他賽納米脂質(zhì)載體使兩種細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡的數(shù)量均有所提高。(3)細(xì)胞周期實驗:隨著多西他賽藥物濃度的增加,給藥時間的延長,KB和HT-1080細(xì)胞中DNA被阻滯在G2/M期的比例增大。結(jié)果表明,F/ACPP-DTX-NLC對腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用最強(qiáng)。建立KB細(xì)胞和HT-1080三維體外細(xì)胞腫瘤球模型,考察藥物對實體瘤無血管部分的影響。研究表明,葉酸和ACPP共同修飾的多西他

8、賽納米脂質(zhì)載體可明顯增強(qiáng)多西他賽對KB和HT-1080腫瘤球生長的抑制作用和穿透能力。
　　以 Spraque-Dawley大鼠為研究對象,尾靜脈注射 Taxotere?、DTX-NLC和F/ACPP-DTX-NLC,考察多西他賽體內(nèi)的藥物動力學(xué)。結(jié)果顯示,與市售制劑Taxotere?相比,多西他賽納米脂質(zhì)載體能夠在循環(huán)系統(tǒng)中維持更高的血藥濃度,延長體內(nèi)的滯留時間。
　　以皮下接種KB和HT-1080細(xì)胞的荷瘤BALB/c裸

9、鼠為模型,采用活體成像技術(shù),在體實時觀察游離DiR,DiR-NLC和F/ACPP-DiR-NLC在體內(nèi)組織分布情況,48小時后處死動物,取出主要臟器以及腫瘤組織進(jìn)行離體成像實驗。結(jié)果表明,PEG化葉酸和ACPP的修飾提高了納米脂質(zhì)載體對腫瘤組織的靶向性,有利于藥物在腫瘤部位蓄積。
　　采用KB細(xì)胞皮下接種荷瘤BALB/c裸鼠動物模型,考察了尾靜脈注射多西他賽系列制劑 Taxotere?, DTX-NLC,ACPP-DTX-NLC,

10、 CPP-DTX-NLC, F-DTX-NLC和F/ACPP-DTX-NLC的抗腫瘤效果。通過原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)考察誘導(dǎo)組織細(xì)胞凋亡的作用。采用免疫組化法對腫瘤組織細(xì)胞的微管蛋白進(jìn)行標(biāo)記研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),F/ACPP-DTX-NLC能夠顯著增加腫瘤細(xì)胞的凋亡;提高對腫瘤細(xì)胞的微管蛋白的解聚抑制作用,顯著增加多西他賽抗腫瘤生長抑制作用。
　　抗腫瘤治療過程中,以生理鹽水組為對照,觀察各制劑組裸鼠體重變化、血紅蛋白含量

11、、白細(xì)胞計數(shù)、粒細(xì)胞計數(shù),結(jié)果表明血象指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。相比之下,Taxotere?組由于骨髓抑制作用和溶血性造成骨髓有核細(xì)胞減少,體重下降明顯。多西他賽納米脂質(zhì)載體較 Taxotere?具有更好的耐受性和更低的毒副作用。
　　綜上所述,本研究成功構(gòu)建了PEG化葉酸和ACPP共同修飾的多西他賽納米脂質(zhì)載體,進(jìn)行制劑學(xué)表征。葉酸和ACPP的共同修飾提高了多西他賽納米脂質(zhì)載體對腫瘤細(xì)胞的靶向內(nèi)化作用,增強(qiáng)了增殖抑制作用,對腫瘤組織具