蛛絲蛋白MiSp全長(zhǎng)基因克隆、表達(dá)及結(jié)構(gòu)和功能研究.pdf

1、圓網(wǎng)蜘蛛可分泌六種蛛絲蛋白纖維，分別在蜘蛛生命活動(dòng)中扮演不同的角色。次壺腹腺絲(minor ampullate silk)主要用于構(gòu)建蛛網(wǎng)核心框架和包裹獵物等，具有顯著的機(jī)械性能和優(yōu)異的生物親和性，加之在水環(huán)境中不會(huì)發(fā)生超收縮（超收縮會(huì)嚴(yán)重影響絲蛋白纖維的性能）等，是一種優(yōu)質(zhì)的、難得的天然生物材料，在軍工、航空航天以及生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域有著巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　蜘蛛生性偏愛獨(dú)居（同類殘食），紡絲量也遠(yuǎn)少于家蠶，因此無(wú)法像高密度飼

2、養(yǎng)家蠶一樣大規(guī)模獲取蛛絲纖維，嚴(yán)重阻礙了蜘蛛絲在現(xiàn)代科技生活中的大規(guī)模應(yīng)用。自二十世紀(jì)九十年代以來(lái)，隨著生物技術(shù)日趨成熟，人們開始探索通過(guò)生物技術(shù)的方法制備人造蜘蛛絲，以滿足現(xiàn)代科技發(fā)展對(duì)高品質(zhì)纖維材料的需求。多年來(lái)國(guó)內(nèi)外多家研究機(jī)構(gòu)專注于重組蛛絲纖維的仿生制備，但到目前為止尚未有一家機(jī)構(gòu)能夠仿生類似天然蛛絲的人造蛛絲纖維，嚴(yán)重限制這種新型戰(zhàn)略資源的產(chǎn)業(yè)化。
　　長(zhǎng)期研究表明，國(guó)內(nèi)外蛛絲蛋白纖維的人工仿生之所以進(jìn)展緩慢，主要是因?yàn)?/p>

3、現(xiàn)階段面臨三大瓶頸問(wèn)題:1）蛛絲蛋白全長(zhǎng)編碼基因克隆滯后:蛛絲蛋白編碼基因大、重復(fù)度高以及GC含量顯著等，常規(guī)PCR和小型cDNA文庫(kù)技術(shù)很難釣取全長(zhǎng)編碼基因，經(jīng)過(guò)近25年的克隆研究國(guó)內(nèi)外僅報(bào)道三種蛛絲蛋白全長(zhǎng)基因序列（其中第二條為本論文克隆）;2）全長(zhǎng)編碼基因外源表達(dá)難以實(shí)現(xiàn):蛛絲蛋白全長(zhǎng)編碼基因大，編碼的絲素蛋白達(dá)到300kDa左右;基因序列重復(fù)度高，容易出現(xiàn)基因重組和缺失等;蛛絲蛋白基因GC含量高，容易形成特殊的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，

4、導(dǎo)致核糖體脫落和翻譯提前終止等;蛛絲蛋白中Gly和Ala使用頻率過(guò)高，表達(dá)過(guò)程中給宿主壓力太大;3）成絲機(jī)理研究不足:蛛絲蛋白分泌腺尺寸太小，腺體內(nèi)環(huán)境（生理及化學(xué)條件）尚沒(méi)明確;蛛絲蛋白由N端和C端非重復(fù)調(diào)節(jié)區(qū)域以及中間重復(fù)區(qū)Rp組成，它們相互協(xié)調(diào)共同賦予液態(tài)蛛絲蛋白以及固態(tài)蛛絲纖維的高度可控特性和優(yōu)良品質(zhì)，現(xiàn)階段相關(guān)NT和CT的結(jié)構(gòu)和功能還沒(méi)有解析完全，Rp與絲性能的關(guān)系也不明確;次壺腹腺絲蛋白（minor ampullate sp

5、idroin，MiSp）中還包含特有的spacer間隔區(qū)，結(jié)構(gòu)和功能還有待研究;由于腺體內(nèi)環(huán)境以及蛛絲蛋白成絲機(jī)理研究的嚴(yán)重不足，致使人工纖維的仿生方法比較單一。
　　為系統(tǒng)性突破上述三個(gè)瓶頸問(wèn)題，為產(chǎn)業(yè)化高品質(zhì)重組蛛絲纖維奠定基礎(chǔ)，本論文首次以MiSp為研究對(duì)象，主要內(nèi)容包括以下三個(gè)方面:
　　部分一:克隆鑒定MiSp全長(zhǎng)編碼基因。大腹園蛛(Araneus ventricosus)是我國(guó)廣泛分布的蜘蛛種屬之一，絲纖維綜合品

6、質(zhì)優(yōu)異，國(guó)內(nèi)外多家研究機(jī)構(gòu)均在進(jìn)行A.ventricosus絲蛋白編碼基因的鑒定分析。次壺腹腺絲作為一種新型的蛛絲蛋白纖維，研究相對(duì)滯后，除了少量短的cDNA序列報(bào)道外，表達(dá)和仿生均無(wú)涉及。為了促進(jìn)MiSp蛋白成絲機(jī)理的解析、全長(zhǎng)MiSp蛋白重組表達(dá)、開發(fā)及仿生應(yīng)用、為蛛絲蛋白的進(jìn)化和表達(dá)調(diào)控研究增添新成員，本章基于前期構(gòu)建的A.ventricosus大型fosmid基因組文庫(kù)和STS/3D-PCR技術(shù)篩選鑒定MiSp全長(zhǎng)編碼基因序列。

7、經(jīng)過(guò)多輪篩選，我們得到含有A.ventricosus MiSp全長(zhǎng)編碼基因的陽(yáng)性克隆，外源插入片段約33kb左右(GenBank accession no.JX513956)，覆蓋MiSp全長(zhǎng)編碼基因及其上游6647bp和下游14937bp非編碼序列。A.ventricosus MiSp全長(zhǎng)編碼基因長(zhǎng)10.9kb，由兩個(gè)外顯子(exon)和一個(gè)在蛛絲蛋白基因中首次發(fā)現(xiàn)的基因內(nèi)含子（intron）組成。A.ventricosus MiSp

8、 intron長(zhǎng)5628bp，以GT起始AG終止，符合intron的GT-AG法則。A.ventricosus MiSp全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄子為5440bp，編碼的1766個(gè)氨基酸可劃分為N端和C端非重復(fù)區(qū)以及中間占到90％以上的重復(fù)區(qū)，其中重復(fù)區(qū)含有四種重復(fù)模塊（由Gly-X、Gly-Gly-X、Gly-Gly-Gly-X和poly-Ala組成）和兩個(gè)特有的DNA水平相似度為100％的間隔區(qū)（spacer，126個(gè)氨基酸殘基）。A.ventric

9、osusMiSp全長(zhǎng)編碼基因組成結(jié)構(gòu)揭示了蛛絲蛋白編碼基因intron-exon結(jié)構(gòu)多樣性，上下游調(diào)控序列的比對(duì)分析為進(jìn)一步研究蛛絲蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控增添了新的保守性調(diào)控元件CACG。A.ventricosusMiSp全長(zhǎng)編碼基因?yàn)閲?guó)內(nèi)外首條MiSp全長(zhǎng)基因序列（世界上第二種全長(zhǎng)蛛絲蛋白編碼基因序列），填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外就A.ventricosus絲蛋白全長(zhǎng)編碼基因克隆的空白，為國(guó)內(nèi)外絲蛋白全長(zhǎng)基因的研究增添新成員。
　　部分二:研

10、究MiSp結(jié)構(gòu)和功能、解析組裝機(jī)制和成絲機(jī)理。常溫下，高濃度蛛絲蛋白經(jīng)過(guò)絲腺內(nèi)部一系列物理和化學(xué)變化，在極短的時(shí)間內(nèi)迅速轉(zhuǎn)變成性能顯著的固態(tài)蛛絲纖維，這一復(fù)雜的纖維化過(guò)程目前尚無(wú)系統(tǒng)性闡述。蛛絲蛋白主要由氨基酸水平高度重復(fù)的重復(fù)區(qū)域構(gòu)成（Rp，占到整個(gè)蛋白90％以上），Rp兩端分別為N端(NT，約110氨基酸殘基)和C端非重復(fù)區(qū)（CT，約130個(gè)氨基酸殘基）。Rp區(qū)域主要與蛛絲纖維機(jī)械性能和品質(zhì)相關(guān)，NT和CT則主要參與高濃度蛛絲蛋白儲(chǔ)

11、液的維持及纖維化過(guò)程中對(duì)蛛絲蛋白的多種調(diào)節(jié)作用。前期研究推斷拖絲蛋白(major ampullate spidroin，MaSp)NT和CT在蛛絲蛋白成絲過(guò)程中以相似的方式發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，本論文研究則證實(shí)次壺腹腺絲蛋白MiSpNT和CT在蛛絲蛋白纖維化過(guò)程中以相反的作用方式分別扮演不同的角色。A.ventricosus MiSp除了擁有蛛絲蛋白典型的三個(gè)結(jié)構(gòu)域NT、CT和Rp外，還含有兩個(gè)spacer區(qū)域。我們前期對(duì)Nephila cla

12、vipes主壺腹腺體的pH值(pH7.6-5.7，這是到目前為止測(cè)得的最寬pH范圍)和多種離子種類及濃度進(jìn)行測(cè)試，并發(fā)現(xiàn)腺體導(dǎo)管中含有碳酸酐酶（催化CO2+H2O(→)HCO3-+H+反應(yīng)維持pH梯度）。參照腺體內(nèi)環(huán)境變化趨勢(shì)，我們對(duì)A.ventricosus MiSp NT、CT以及spacer的功能和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)性研究:1）隨著pH從7.5降至5.0，MiSpNT逐漸二聚化且二聚體穩(wěn)定性逐漸增強(qiáng)，連接蛛絲蛋白單體形成牢固的蛛絲蛋白

13、多聚體，NaCl可維持單體穩(wěn)定性延緩NT二聚化;pH7.5至5.0，MiSpNT二級(jí)結(jié)構(gòu)維持α-helix構(gòu)象不變，高溫可誘導(dǎo)NT由α-helix向random coil可逆轉(zhuǎn)變。NMR高級(jí)結(jié)構(gòu)顯示A.ventricosus MiSpNT單體由5個(gè)α-helix構(gòu)成，Arg64和Glu115形成分子內(nèi)鹽鍵，位于α-helix1和4上的兩個(gè)Cys形成分子內(nèi)二硫鍵。與EuprosthenopsaustralisMaSp1NT不同，A.ven

14、tricosus MiSpNT中沒(méi)有參與MaSp1NT第三步二聚化的保守Glu84，但Asp109高度保守，揭示了MiSp不一樣的二聚化機(jī)制;2)我們首次發(fā)現(xiàn)隨著pH值的降低，A.ventricosus MiSp CT始終維持二聚體構(gòu)象但二聚體穩(wěn)定性逐漸降低（與NT相反），與MiSpNT不同，pH7.5-6.5時(shí)CT的高溫變性過(guò)程可逆，二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-helix向random coil轉(zhuǎn)變，pH降至5.5時(shí)高溫可誘導(dǎo)MiSpCT由α-he

15、lix向β-sheet不可逆轉(zhuǎn)變。pH≦5.5時(shí)CT結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（解折疊）形成β-sheet淀粉狀(amyloid)納米纖維（通過(guò)透射電鏡和Congo染色證實(shí)），作為重復(fù)區(qū)Rp快速纖維化的晶核，NaCl對(duì)納米纖維的形成具有抑制作用，NT不具備形成β-sheetamyloid納米纖維的能力(pH7.5-5.0)。NMR高級(jí)結(jié)構(gòu)證實(shí)A.ventricosus MiSp CT單體與MiSpNT相似，由5個(gè)α-helix構(gòu)成，α-helix2和

16、4通過(guò)Arg43和Glu87形成鹽鍵，單體之間主要依靠疏水作用二聚化，其中α-helix5伸向?qū)?yīng)單體內(nèi)部形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。導(dǎo)管末端pH值低以及HCO3-濃度上升，因此導(dǎo)管末端的pCO2較高，我們?cè)诜肿铀阶C實(shí)C52（CO2類似物，CO2難以操控以及改變pH值）會(huì)與CT內(nèi)部區(qū)域保守的疏水氨基酸結(jié)合改變蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)去折疊纖維化，NT則不受CS2的影響。碳酸酐酶、NT穩(wěn)定性增強(qiáng)以及CT穩(wěn)定降低的起始部位均發(fā)生在腺體的相同位置，證實(shí)CO2和

17、質(zhì)子依懶型的蛛絲蛋白成絲新機(jī)制;3）不同于NT和CT，A.ventricosus MiSp spacer結(jié)構(gòu)域不受pH值影響，維持α-helix構(gòu)象不變，Tm值均為50℃左右，高溫可誘導(dǎo)spacer蛋白由α-helix向random coil轉(zhuǎn)變;A.ventricosus MiSp spacer主要為蛋白四聚體（存在少量單體構(gòu)象），可拉近蛛絲蛋白分子形成復(fù)雜的蛛絲蛋白網(wǎng)鏈，增加絲纖維力學(xué)性能;NaCl可穩(wěn)定spacer單體構(gòu)象，但不能

18、完全抑制蛋白四聚體的生成;A.ventricosus MiSp spacer可快速自組裝并纖維化，形成肉眼可見的短小絲纖維。通過(guò)對(duì)A.ventricosus MiSp NT、CT和spacer結(jié)構(gòu)域系統(tǒng)性的結(jié)構(gòu)和功能研究，建立了蛛絲蛋白全新的成絲機(jī)理模型，為高品質(zhì)蛛絲蛋白纖維的仿生提供了新的制備工藝。
　　部分三:實(shí)現(xiàn)全長(zhǎng)蛛絲蛋白的外源定向拼接。完整的蛛絲蛋白是制備高品質(zhì)蛛絲纖維的保障，目前蛛絲蛋白的外源表達(dá)均是部分基因產(chǎn)物或是重

19、復(fù)模塊的嵌合體，與天然蛛絲蛋白存在較大差異，仿生的單絲纖維性能遠(yuǎn)不及天然蛛絲。在過(guò)去十幾年科學(xué)家們多次嘗試不同的表達(dá)系統(tǒng)制備蛛絲蛋白，但效果均不理想。為了尋求適合全長(zhǎng)蛛絲蛋白的制備方法，本論文首次以A.ventricosus MiSp全長(zhǎng)編碼基因?yàn)檠芯繉?duì)象，分別嘗試不同的外源表達(dá)方法制備全長(zhǎng)蛛絲蛋白。A.ventricosus MiSp全長(zhǎng)編碼基因大、Gla/Ala使用頻率高等，很難在大腸桿菌中全長(zhǎng)表達(dá)。本論文首先1）以Rosetta2

20、(DE3)為宿主表達(dá)A.ventricosus MiSp全長(zhǎng)編碼基因，SDS-PAGE顯示MiSp全長(zhǎng)編碼基因難以表達(dá)或者表達(dá)量及其微小，而且還伴隨大量翻譯不完全的MiSp蛋白分子。為了尋求簡(jiǎn)單高效的全長(zhǎng)蛛絲蛋白的制備方法，本論文2）借助Rbintein的反式剪接技術(shù)，在國(guó)內(nèi)外首次嘗試體外定向拼接全長(zhǎng)A.ventricosus MiSp重組蛋白。我們將MiSp全長(zhǎng)編碼基因分成兩部分，并分別與Rbn和Rbc融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物分別為AvMi

21、SpNTRbn和RbcAv MiSp CT。Av MiSp NT Rbn和RbcAv MiSp CT按等比例混合后，Rbn和Rbc在體外低濃度DTT誘導(dǎo)下相互識(shí)別并定向剪接，AvMiSpNT和AvMiSpCT隨著剪接反應(yīng)通過(guò)肽鍵連接成為完整的MiSp蛋白。Intein介導(dǎo)的A.ventricosus MiSp全長(zhǎng)蛋白拼接是一種全新的合成方法，可以有效的實(shí)現(xiàn)全長(zhǎng)蛛絲蛋白（高分子量）的外源制備，為后續(xù)高品質(zhì)重組蛛絲纖維的仿生和應(yīng)用提供技術(shù)保