副溶血弧菌不耐熱溶血毒素基因的克隆、表達(dá)及表達(dá)蛋白的復(fù)性和功能的研究.pdf

1、研究目的:該研究旨在利用編碼TLH毒素的t1h基因在副溶血弧菌存在的廣泛性和種屬特異性,克隆t1h基因,構(gòu)建原核副合表達(dá)載體,純化獲得具有生物活性功能的TLH,對(duì)其功能、致病性和免疫原性等方面進(jìn)行研究.研究方法:1.以副溶血弧菌國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)株Vp14-90基因組DNA為模板,擴(kuò)增t1h基因,構(gòu)建克隆載體pGEM=t1h,酶切及PCR分析鑒定.2.將PCR產(chǎn)物t1h-90進(jìn)行序列測(cè)定,利用Internet國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)上的有關(guān)生物信息網(wǎng)站對(duì)t1h

2、14-90基因進(jìn)行生物信息分析.3.利用基因工程技術(shù),構(gòu)建副合表達(dá)載體pET32a-t1h,轉(zhuǎn)化宿主菌DE3,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),通過(guò)酶切、PCR、SDS-PAGE電泳及Western-blot分析鑒定.4.優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件,用強(qiáng)變性劑尿素溶解以包涵體形式存在的表達(dá)產(chǎn)物,親合層析純化目標(biāo)蛋白.5.采用逐步透析的方法復(fù)性純化蛋白,獲得了具有生物活性功能的蛋白TLH14-90,通過(guò)溶血功能的研究、兔腸結(jié)扎實(shí)驗(yàn)、兔小腸病理改變的研究、溶血抑制實(shí)

3、驗(yàn)、耐熱實(shí)驗(yàn)、ELISA、Western-blot等對(duì)TLH功能、致病性和免疫原性進(jìn)行研究.結(jié)論:1.在國(guó)內(nèi)首次克隆、測(cè)定了副溶血弧菌不耐熱溶血毒素t1h基因.克隆測(cè)定了中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)株Vp14-90不耐熱溶血毒素t1h基因,t1h14-90測(cè)序結(jié)果被GeneBank收錄,登錄號(hào)為AY289609,填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)相關(guān)資料的空白.2.生物信息分析表明t1h14-90基因全長(zhǎng)1257bp,含有啟動(dòng)子和終止密碼子,與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株WP1的t1h基因同源性較

4、高(99﹪).預(yù)測(cè)其編碼418個(gè)氨基酸,分子式為C<,2131>H<,3184>O<,649>S<,16>,分子量47.3929kDa,理論等電點(diǎn)pI為4.92,疏水性性強(qiáng),預(yù)測(cè)其二級(jí)折疊結(jié)構(gòu)可能為α/□蛋白,與SWISS-PROPT中收錄TLH(WP1)序列同源性為99﹪.3.構(gòu)建了原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-t1h,誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物為以包涵體形式存在的融合蛋白,含有6×his,,分子量約為63KDa.4.通過(guò)親合層析純化和逐步透析復(fù)性