不同環(huán)境樣品中副溶血性弧菌毒力基因表達差異研究及副溶血性弧菌活菌定量方法的建立.pdf

1、副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性海洋細菌,是導致海產品性腸胃炎的主要病原菌。該菌廣泛分布于全世界范圍內的河口、海洋及近海環(huán)境中。近年來副溶血性弧菌的感染病例呈上升趨勢,給水產品養(yǎng)殖和海產品消費帶來極大的安全隱患。研究表明,副溶血性弧菌主要致病因子是溶血素類,它們是耐熱直接溶血素(TDH)、耐熱相關溶血素(TRH)以及不耐熱溶血素(TLH)。另外,海蝦中的副溶血弧菌檢出率高達90％,嚴重威脅人體健康及水產品養(yǎng)殖業(yè)者。
　　基因表達分析在

2、生命科學的研究領域中變得日趨重要,而隨之產生的反轉錄熒光定量PCR(qRT-PCR)技術已成為了以高通量和準確的基因表達定量為特點的基因表達分析的首選方法,可用于常規(guī)的病原微生物檢測、單核苷酸多態(tài)性分析以及基因表達分析。目前,針對副溶血性弧菌毒力基因表達已經開展了初步的研究,但這些研究主要都是基于副溶血性弧菌的實驗室純培養(yǎng)條件以及單一的物理化學因素影響下的基因表達變化,存在一定的局限性。相關弧菌基因表達研究中發(fā)現,病原菌生存的真實環(huán)境對

3、于研究其基因表達情況是十分重要的,在研究其毒力因子表達情況時,應盡量接近其生存的真實環(huán)境。另外選用表達穩(wěn)定的基因作為校正內參對于完整的基因表達評價體系的建立是十分必要的。國內外針對內參基因的篩選已經有了大量的報道,但是多局限于植物和動物,而在致病微生物毒力基因表達方面的相關研究中對內參基因篩選的關注較少。因此,本研究從副溶血性弧菌廣泛分布的水體環(huán)境出發(fā),以蝦樣品中、海水樣品中、過濾海水樣品以及純培養(yǎng)條件下的副溶血性弧菌為研究材料,先針對

4、實驗材料以及處理條件的不同篩選出表達穩(wěn)定的管家基因作為表達分析的內參基因。后續(xù)采用qRT-PCR技術,對不同菌株以及不同環(huán)境條件處理后副溶血性弧菌tdh、trh和tlh基因的表達差異進行分析,希望為進一步揭示環(huán)境因子對毒力基因表達調控的機制及其不同毒力基因的環(huán)境適應性的相關研究打下基礎。
　　近年來,隨著分子生物學檢測技術的不斷發(fā)展,已建立起許多基于熒光定量PCR的海產品中副溶血性弧菌的檢測方法,這些方法憑借其特異性好,靈敏度高且

5、耗時短等優(yōu)點已得到了較廣泛的應用。目前這些熒光定量PCR的檢測技術大多基于DNA樣品,但由于無法從DNA水平區(qū)分出檢測樣品中的死細胞、活細胞以及不可培養(yǎng)細胞,這樣會使我們過高或錯誤的估計樣品所存在的風險。隨之產生的反轉錄熒光定量PCR(qRT-PCR)技術,采用mRNA模板來取代DNA模板,可很大程度上降低活菌檢測中的假陽性結果出現的概率,得到更準確可靠的檢測結果。所以,本研究建立了一種基于RNA技術的副溶血性弧菌的活菌檢測方法。實驗結

6、果表明:
　　1、目前針對于食品樣品中微生物總RNA的提取尚無一個成熟的方法,是后續(xù)相關分析的一大難點。因此我們首先對蝦樣品中副溶血性弧菌總RNA提取條件進行了優(yōu)化,設置了兩種細胞恢復溶液:0.85%生理鹽水和0.1%蛋白胨溶液,以及兩種均質方法,均質器勻漿和晃動均質,恢復溶液和均質方法亮亮組合進行提取效果的對比。結果顯示晃動均質以及0.85%生理鹽水組合提取的方法,能夠從蝦樣品中提取得到較高純度和完整性的副溶血性弧菌總RNA,可

7、供后續(xù)基因表達分析實驗使用。
　　2、采用geNorm軟件計算并分析了相關文獻中已發(fā)表的4種副溶血性弧菌管家基因的表達穩(wěn)定性,表達穩(wěn)定性排列順序為pvuA>pvsA>GAPDH>rpoS,再經過最優(yōu)內參基因數目評價,確定了以pvuA和pvsA兩個基因的幾何平均值作為參照可更為準確地校正目的基因的表達。結果證明pvuA和pvsA基因可作為環(huán)境樣品中副溶血性弧菌毒力基因表達變化研究的內參基因。
　　3、采用qRT-PCR方法對5

8、株菌在不同溫度的海水、過濾海水及蝦樣品中毒力基因的表達變化情況進行了分析,結果初步顯示來源于不同菌株的毒力基因對環(huán)境條件的適應能力存在差異。不同菌株的trh及tlh基因顯示出了一定的低溫高表達的特點;其次tdh基因表達的溫度依賴性不顯著,但QD菌株的tdh基因顯示出了較高的饑餓耐受能力;另外攜帶有tdh及trh毒力基因菌株的tlh基因表達量與僅攜帶tlh基因菌株的tlh基因表達量之間存在較大的差異,由此推測tdh及trh基因的存在對tl

9、h基因的表達量有一定的影響。
　　4、本研究首次建立了一種基于RNA技術的蝦中副溶血性弧菌的活菌定量方法。該方法免去了傳統分離定量方法的增菌和培養(yǎng)過程,可在5小時之內完成整個實驗,而且彌補了DNA定量方法的不足,排除了死細胞的干擾,能夠準確對蝦樣品中活的副溶血性弧菌進行定量,反映出樣品的真實致病風險。設計得到的tlh基因的引物特異性較高,RNA標準品以及標準曲線線性關系良好,方法檢測限可達到58cfu/g樣品,可用于實際樣品的檢測