超高壓脅迫改變副溶血性弧菌毒力的機(jī)理研究.pdf

1、本文對從胃腸道患者糞便中分離得到的副溶血性弧菌C4株進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行多輪的超高壓處理獲得具有耐壓遺傳特性的耐壓株N11。通過溶血實驗、生物被膜形成能力和小鼠急性毒性實驗、小鼠臟器損傷程度，來比較原始株C4和耐壓株N11的體內(nèi)毒力和體外毒力。以原始株C4和耐壓株N11的全基因組DNA為模板，構(gòu)建C4株的Paired-end library、Mate-pair library文庫和N11株的Paired-endlibrary文庫，進(jìn)而采用I

2、llumina高通量測序技術(shù)進(jìn)行測序。對C4株的全基因組序列進(jìn)行拼接、注釋、預(yù)測和COG分類，結(jié)合N11株的全基因組測序結(jié)果進(jìn)行兩者間的比較基因組分析，以篩選N11株內(nèi)發(fā)生的突變堿基。最后，利用實時熒光定量PCR技術(shù)考察受突變位點(diǎn)調(diào)控的基因和毒力相關(guān)基因在C4和N11這兩株菌之間的差異表達(dá)，以分析超高壓脅迫改變副溶血性弧菌毒力的機(jī)理，為食品安全以及細(xì)菌毒性變化提供生物學(xué)依據(jù)。具體結(jié)論如下:
　　對從胃腸道患者糞便中分離得到的菌株進(jìn)

3、行生化和基因型的鑒定，確定該菌株為副溶血性弧菌，并命名為C4株。以C4株為研究對象，經(jīng)過多輪超高壓馴化，得到耐壓株N11。溶血實驗表明C4和N11這兩株菌均有微弱的溶血現(xiàn)象，但是無法比較它們的毒力大小。生物被膜形成能力結(jié)果顯示，C4株的形成能力顯著高于N11株。小鼠急性毒性實驗表明，N11株的半數(shù)致死劑量(LD50)高于C4株;而進(jìn)一步的小鼠臟器病理學(xué)分析結(jié)果亦顯示N11株對小鼠臟器的損傷程度較低，即超高壓處理減弱了副溶血性弧菌的毒力。

4、
　　對高通量測序得到的C4株reads進(jìn)行組裝和拼接，最終得到含有12個scaffolds的全基因組序列，其中CDS、tRNA、rRNA的數(shù)量分別為4850、110、11個?；谌蚪M蛋白質(zhì)序列所構(gòu)建的進(jìn)化樹表明，C4株與副溶血性弧菌的親緣關(guān)系最近，這進(jìn)一步證實C4株為副溶血性弧菌，以及基因預(yù)測的結(jié)果也較為理想。COG分類發(fā)現(xiàn)C4株內(nèi)有38％的基因參與了細(xì)菌的代謝過程;差異位點(diǎn)分析表明，N11株相對于C4株有4個區(qū)域共21個核

5、苷酸發(fā)生了突變。
　　對C4株全基因組序列上的毒力相關(guān)基因進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)C4株中存在編碼TDH-S、TDH-A、TLH的基因，但未發(fā)現(xiàn)編碼TRH的基因;存在兩組編碼Ⅳ型菌毛(TypeⅣpili，TFP)的基因，分別為角質(zhì)菌毛(Chitin-regulated pilus，ChiRP)以及甘露醇敏感凝血素Ⅳ型菌毛(mannose-sensitive hemagglutinin，MSHA);存在兩個Ⅲ型分泌系統(tǒng)，分別為TTSS1和TT

6、SS2;未發(fā)現(xiàn)編碼尿素酶的基因。
　　以培養(yǎng)中的C4和N11株的mRNA為模板，采用實時熒光定量PCR分析毒力基因的相對表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)編碼主要溶血毒素和MSHA的基因在N11株中的表達(dá)量顯著低于C4株，溶血毒素是副溶血性弧菌中的主要毒力因子，N11株表達(dá)量的減少可能是其毒力降低的主要原因。此外，通過實時熒光定量PCR分析了受突變位點(diǎn)調(diào)控的上下游基因:C4_4795基因編碼生成RNA結(jié)合蛋白，發(fā)現(xiàn)該基因的mRNA表達(dá)水平發(fā)生下調(diào)，推