溫度影響副溶血性弧菌生物被膜形成的初步機(jī)理研究.pdf

1、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是水產(chǎn)品中主要的食源性致病菌，易粘附在各種食品和食品接觸材料表面，通過自身的繁殖并分泌大量的代謝產(chǎn)物，將細(xì)菌包裹其中而形成復(fù)雜的三維立體膜狀結(jié)構(gòu)，即細(xì)菌生物被膜（Biofilm，BF）。生物被膜可以大大增強(qiáng)細(xì)菌對各種外界環(huán)境因素（消毒劑、壓力、低溫等）的抵抗性，給食品加工和生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。在自然界中， VP的生長繁殖和海水溫度的變化密切相關(guān)；在食品的生產(chǎn)和加工過程中

2、， VP需要經(jīng)歷一系列的溫度變化過程。因此，對不同溫度下VP生物被膜的動態(tài)形成過程及溫度影響生物被膜形成的機(jī)制進(jìn)行探究，對于食品安全和食品工業(yè)的發(fā)展均有重要的意義。
　　本研究以VP為研究對象，首先，對不同溫度（15 oC，25℃，37℃）條件下生物被膜的動態(tài)形成過程進(jìn)行分析；其次，探究了預(yù)形成的生物被膜經(jīng)歷低溫冷擊后形成特性的變化；最后，利用拉曼光譜和反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR（RT-qPCR）等方法探究溫度影響生物被膜的初步機(jī)理，為

3、有效控制生物被膜的形成提供理論參考。本文主要研究內(nèi)容及研究結(jié)果如下：
　　1.不同溫度條件下副溶血弧菌生物被膜的動態(tài)形成過程
　　本研究運(yùn)用結(jié)晶紫染色法分析了食品中分離的VP在不同溫度下的動態(tài)形成過程，并比較了臨床分離與食品分離的VP的被膜形成能力，最后利用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察BF形成過程中的結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果顯示，15℃時(shí)，BF的形成量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸增加；25℃時(shí)，25℃時(shí)BF的形成能力最強(qiáng)，BF的形成量在前期逐

4、漸增加直至24 h時(shí)達(dá)到最大量；而37℃時(shí)， BF增加緩慢。此外，致病性VP的被膜形成能力強(qiáng)于非致病性VP；臨床分離VP的BF形成能力顯著強(qiáng)于（p＜0.05）食品分離菌株。變異性分析顯示，菌株的變異性隨著培養(yǎng)溫度的升高而逐漸增大，培養(yǎng)時(shí)間為12 h時(shí)變異性最大。2.低溫刺激對預(yù)形成的副溶血性弧菌生物被膜形成特性的影響
　　本文研究了低溫（4℃，10℃）刺激對預(yù)形成的VP生物被膜形成特性的影響，并分析了被膜菌的活菌數(shù)變化。結(jié)果表明，

5、與37℃恒溫培養(yǎng)條件相比，低溫刺激后BF的形成速度降低，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，BF的形成量逐漸增加至與恒溫培養(yǎng)的形成量相近。EPS分析發(fā)現(xiàn)，低溫刺激后胞外多糖和胞外蛋白仍呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢，并在48 h時(shí)達(dá)到最大，然后開始逐漸下降；平板涂布法測定低溫刺激后被膜菌的活菌數(shù)發(fā)現(xiàn)，低溫刺激后的被膜菌的活菌數(shù)顯著高于（p＜0.05）未低溫刺激的活菌數(shù)。以上結(jié)果表明，低溫刺激只能減緩生物被膜的形成速度，細(xì)菌一旦適應(yīng)了低溫環(huán)境就會快速的生長繁殖并

6、形成更多的生物被膜；低溫刺激還可以有效的保護(hù)細(xì)菌，從而危害食品安全。
　　3.溫度影響副溶血性弧菌生物被膜的初步機(jī)理
　　本研究利用掃描電鏡觀察了不同溫度下BF的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并利用拉曼光譜和 RT-qPCR等方法，從代謝產(chǎn)物和基因水平探究了溫度影響VP生物被膜的初步機(jī)理。結(jié)果表明，25℃時(shí)BF的結(jié)構(gòu)最致密，胞外多糖和胞外蛋白的量也最大，37℃次之，15℃較弱，4℃最弱。拉曼光譜分析發(fā)現(xiàn)，不同溫度下的特征峰數(shù)量和強(qiáng)度均有顯著性差