副溶血性弧菌電化學(xué)免疫傳感器的研制.pdf

1、細(xì)菌性食物中毒是影響食品安全的一個非常重要的因素。副溶血性弧菌(VP)是一種嗜鹽性細(xì)菌，通常存在于近海海水、海底沉積物、浮游生物、海產(chǎn)品(魚類和貝類)及腌漬食品中，是夏秋季沿海地區(qū)引發(fā)食物中毒的首要病原菌。人多因食入未煮熟的海產(chǎn)品或污染此菌的鹽漬食物而感染，潛伏期為2～26 h，最短僅1 h；主要癥狀為腹痛、腹瀉、嘔吐和發(fā)熱等，糞便為水樣，少數(shù)呈血水樣或粘液血便。如果不及時治療，可能會危急生命。 免疫傳感器是由生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、物理

2、、化學(xué)和電子學(xué)等學(xué)科相互滲透所形成的新研究領(lǐng)域，其在食品安全快速檢測、臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測和軍事等領(lǐng)域都有重要應(yīng)用。憑借其微型化、低成本、特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測快速方便和容易實現(xiàn)在線檢測等優(yōu)點，免疫傳感器已成為當(dāng)前的研究熱點。抗原/抗體固定化技術(shù)是研究和開發(fā)免疫傳感器最為關(guān)鍵和重要的工作。 本論文主要圍繞以下幾個方面開展了一些工作： 1.副溶血性弧菌抗原與抗體的制備 本實驗成功制備了副溶血性弧菌抗原與抗體，平板計

3、數(shù)得抗原濃度為10<'10> cfu/mL，抗原形態(tài)學(xué)表征與文獻(xiàn)報道一致；通過微量滴定凝集法測得抗體效價為128。實驗結(jié)果表明，副溶血性弧菌抗原與抗體都具有良好的生物活性和特異性，這為后續(xù)工作的順利開展奠定了基礎(chǔ)。 2.電極預(yù)處理與表征 本實驗對玻碳電極和絲網(wǎng)印刷電極進(jìn)行預(yù)處理，通過形態(tài)學(xué)表征和電化學(xué)表征驗證預(yù)處理效果。實驗結(jié)果表明，電極預(yù)處理達(dá)到了預(yù)期效果，玻碳電極和絲網(wǎng)印刷電極都具有較好的一致性和重現(xiàn)性，這為后續(xù)實驗

4、的順利開展奠定了基礎(chǔ)。 3.基于殼聚糖金膠和絲網(wǎng)印刷電極的副溶血性弧菌電流型酶免疫傳感器的研制 本實驗將anti-VP摻雜于殼聚糖金膠中，并修飾于絲網(wǎng)印刷電極表面，從而制備一次性副溶血性弧菌免疫傳感器。實驗中采用循環(huán)伏安法和激光掃描共聚焦顯微鏡表征免疫傳感器。采用夾心法檢測VP，免疫傳感器先在待測樣品中室溫孵育30 min，然后在HRP-anti-VP溶液中室溫孵育30 min。采用循環(huán)伏安法監(jiān)測酶促反應(yīng)，通過免疫反應(yīng)結(jié)

5、合于免疫電極表面的HRP-anti-VP能夠催化硫堇和過氧化氫，利用還原電流的增大來測定樣品中的VP。在優(yōu)化的免疫反應(yīng)條件及電化學(xué)檢測條件下，設(shè)定判定標(biāo)準(zhǔn)如下：△i<0.1μA為陰性；△i≥0.1μA為陽性。該免疫電極具有較好的特異性、重現(xiàn)性(RSD<9％)、穩(wěn)定性(一周后電流響應(yīng)為初始值的87％)和準(zhǔn)確性(與EIJSA符合率為95％)。因此，該免疫傳感器可初步用于VP的快速篩檢。 4.基于瓊脂糖/納米金膜和絲網(wǎng)印刷電極的副溶血

6、性弧菌電流型酶免疫傳感器的研制 本實驗將HRP-anti-VP摻雜于瓊脂糖和納米金中，并修飾于絲網(wǎng)印刷電極表面，從而制備一次性副溶血性弧菌免疫傳感器。實驗中采用循環(huán)伏安法和激光掃描共聚焦顯微鏡表征免疫傳感器。采用一步法檢測VP，免疫傳感器在待測樣品中室溫孵育30 min?？乖豢贵w免疫反應(yīng)生成的免疫復(fù)合物部分屏蔽了免疫電極表面HRP的活性中心，從而減弱了HRP對硫堇和過氧化氫的催化能力。采用循環(huán)伏安法監(jiān)測酶促反應(yīng)，利用還原電流的

7、減小來測定樣品中的VP。在優(yōu)化的免疫反應(yīng)條件及電化學(xué)檢測條件下，設(shè)定判定標(biāo)準(zhǔn)如下：△i<0.05μA為陰性；△i≥0.05μA為陽性。該免疫電極具有較好的特異性、重現(xiàn)性(RSD<6％)、穩(wěn)定性(一周后電流響應(yīng)為初始值的91％)和準(zhǔn)確性(與ELISA符合率為97.5％)。因此，該免疫傳感器可初步用于VP的快速篩檢。 5.基于Nation/硫堇/納米金的副溶血性弧菌無試劑電流型免疫傳感器的研制 本實驗采用靜電吸附原理和自組裝

8、技術(shù)將Nafion、硫堇、納米金和anti-VP修飾到玻碳電極表面形成敏感膜，從而制備副溶血性弧菌無試劑電流型免疫傳感器。實驗中采用電化學(xué)方法表征免疫傳感器的制備過程。無需酶標(biāo)抗體和復(fù)雜操作，根據(jù)抗原_抗體特異性結(jié)合形成的免疫復(fù)合物使得敏感膜有效擴(kuò)散截面積減小，從而抑制硫堇氧化還原來實現(xiàn)對VP的檢測。在優(yōu)化的免疫反應(yīng)條件及電化學(xué)檢測條件下，設(shè)定判定標(biāo)準(zhǔn)如下：△i<0.5μA為陰性；△i≥0.5 μA為陽性。該免疫電極具有較好的特異性、重