水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的ELISA快速檢測(cè).pdf

1、細(xì)菌性食物中毒是影響我國(guó)食品安全的一個(gè)非常重要的因素。副溶血性弧菌是引起食物中毒的主要病原菌之一，每年夏秋季是副溶血性弧菌最適生長(zhǎng)季節(jié)，也是其引起食物中毒的高峰期。人如誤食染有此菌的水產(chǎn)品，很容易被感染，潛伏期一般2～26h，主要癥狀有腹痛、腹瀉、嘔吐和發(fā)燒等，水樣糞便，少數(shù)呈血水樣或粘液血便，嚴(yán)重的可能會(huì)危機(jī)生命。 本文通過(guò)制備副溶血性弧菌抗原，免疫新西蘭大白兔獲得效價(jià)高、特異性強(qiáng)的多克隆抗體，并利用此抗體進(jìn)行間接ELISA試

2、驗(yàn)，篩選出最適反應(yīng)條件，建立了副溶血性弧菌間接ELISA檢測(cè)法。此法具有檢測(cè)時(shí)間短、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，為食品中特別是水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢測(cè)提供快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，并為食品中副溶血性弧菌的ELISA快速檢測(cè)試劑盒的研制提供科學(xué)依據(jù)，也為副溶血性弧菌雙抗體夾心ELISA檢測(cè)法的建立提供理論依據(jù)，因此本實(shí)驗(yàn)具有很高的實(shí)際意義。 本課題主要從以下幾方面進(jìn)行了研究： 1、副溶血弧菌抗原和抗體的制備 本實(shí)驗(yàn)結(jié)合甲

3、醛和熱滅活法篩選出副溶血性弧菌最佳滅活條件：用0.05％(V/V)的甲醛、30℃條件下滅活副溶血弧菌4h制備抗原，并以此抗原分多次，劑量遞增，免疫新西蘭大白兔獲得特異性多克隆抗體，以山羊抗兔IgG-HRP作為酶標(biāo)二抗，通過(guò)間接ELIASA法測(cè)定其多克隆抗體的效價(jià)、敏感性和特異性。結(jié)果表明：在免疫的第5周產(chǎn)生大量高效價(jià)抗體，效價(jià)最高可達(dá)1.6×10<'5>：此多克隆抗體對(duì)副溶血弧菌檢測(cè)靈敏度為1×10<'4>cfu/mL；交叉反應(yīng)和阻斷試

4、驗(yàn)結(jié)果顯示此多克隆抗體具有很強(qiáng)的特異性，與鰻弧菌、溶藻弧菌、沙門氏菌等多種菌株均無(wú)交叉反應(yīng)，因此可為間接ELISA檢測(cè)法的建立、試劑盒的研制提供優(yōu)質(zhì)的多克隆抗體，為后續(xù)工作奠定基礎(chǔ)。 2、間接ELISA檢測(cè)法的建立 本文通過(guò)篩選試驗(yàn)，確定各檢測(cè)步驟的最適合反應(yīng)條件，并用棋盤滴定法抗原與抗體的最佳工作濃度，此法標(biāo)準(zhǔn)化后，其檢測(cè)參數(shù)為：采用新的抗原包被法，60℃烘干包被，抗原包被濃度為10<'7>cfu/mL：封閉時(shí)間為2.

5、5h；一抗工作稀釋度為1：4000；抗原、一抗孵育時(shí)間為75min；酶標(biāo)二抗工作稀釋度為1：1000；一抗與酶標(biāo)二抗孵育時(shí)間為60min；酶與底物反應(yīng)溫度為30℃，時(shí)間為15min；孵育溫度為37℃；運(yùn)用此法對(duì)副溶血性弧菌菌懸液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)閾為10<'4> cfu/mL；檢測(cè)時(shí)間為8h。 3、間接ELISA快速檢測(cè)水產(chǎn)品中副溶血性弧菌 以此多克隆抗體作為一抗，山羊抗兔IgG-HRP作為酶標(biāo)二抗，建立副溶血弧菌的間接EL

6、ISA快速檢測(cè)法。將該方法標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，交叉實(shí)驗(yàn)表明，此多克隆抗體與其它菌株交叉反應(yīng)結(jié)果為陰性；阻斷實(shí)驗(yàn)表明其具有較高的特異性，阻斷率高達(dá)86.53％。運(yùn)用此方法分別對(duì)人工染菌水產(chǎn)品及實(shí)際水產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)下限為10<'4>cfu/ml，檢測(cè)時(shí)間為8h；而將樣品經(jīng)過(guò)8h增菌培養(yǎng)后，檢測(cè)下限可提高到10<'3>cfu/ml。運(yùn)用此法與常規(guī)方法分別對(duì)人工染菌水產(chǎn)品及實(shí)際水產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果完全一致，因此本法可為檢測(cè)水產(chǎn)品中副

7、溶血性弧菌提供準(zhǔn)確、快速的方法，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。 4 水產(chǎn)品中副溶血性弧菌間接ELISA快速檢測(cè)試劑盒的初步研制 提出了水產(chǎn)品中副溶血性弧菌ELISA快速檢測(cè)試劑盒的組成部件，使用說(shuō)明，操作注意事項(xiàng)。并對(duì)本試劑盒各組分的保存期，試劑盒的穩(wěn)定性、靈敏度、以及特異性進(jìn)行了評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明本試劑盒可在4℃環(huán)境中，保存時(shí)間是3個(gè)月以上，具有良好的穩(wěn)定性?？稍?h內(nèi)檢測(cè)出10<'4>cfu/ml濃度的副溶血性弧菌，經(jīng)8h增