環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)檢測(cè)海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的研究.pdf

1、背景:
　　副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種廣泛分布于海產(chǎn)品和咸水環(huán)境中的革蘭氏陰性菌，可導(dǎo)致胃腸道炎癥，還能引發(fā)危及生命的敗血癥。國(guó)內(nèi)外發(fā)布的法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)都明確規(guī)定，在眾多食品的檢測(cè)中都要求不得檢出，目前的主要檢測(cè)方法是《GB4789.7-2013食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血性弧菌檢驗(yàn)》，檢驗(yàn)程序包括前增菌-選擇性增菌-選擇性平板分離-生物化學(xué)篩選-血清學(xué)鑒定等步驟，通常需要5～7天才

2、能完成檢測(cè)，操作繁瑣。除傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法外，《SN/T2424-2010進(jìn)出口食品中副溶血性弧菌快速及鑒定檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法》采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法，通過增菌-核酸提取-熒光PCR檢測(cè)步驟，操作相對(duì)簡(jiǎn)便、檢測(cè)周期相對(duì)較短，但需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員，較難滿足市場(chǎng)需求。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification，簡(jiǎn)稱LAMP）是一種新式核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，由日本的Notomi

3、等研發(fā)，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，其原理是針對(duì)靶基因的特定區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，在具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)作用下，能在等溫條件下實(shí)現(xiàn)靶基因的一步擴(kuò)增，引入環(huán)引物后，擴(kuò)增效率還可大大增加。
　　目的:
　　1.針對(duì)副溶血性弧菌的特異性基因—tlh基因設(shè)計(jì)不同引物并對(duì)引物進(jìn)行篩選，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，建立針對(duì)副溶血性弧菌的特異性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好的LAMP方法。
　　2.

4、以優(yōu)化后的LAMP方法為基礎(chǔ)，建立針對(duì)海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的方便快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的LAMP檢測(cè)系統(tǒng)。
　　方法:
　　1.針對(duì)副溶血性弧菌的不耐熱溶血毒素(thermolabile hemolysin，TLH)tlh基因，設(shè)計(jì)2套引物并篩選出出峰時(shí)間早、檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)、無非特異性擴(kuò)增的引物序列，在反應(yīng)體系中加入SYTO-9熒光染料，60～65℃的恒溫條件下保溫30～60min，即可完成靶序列的特異性擴(kuò)增，通過儀器可實(shí)時(shí)監(jiān)

5、測(cè)反應(yīng)結(jié)果。對(duì)建立的LAMP方法從Mg2+濃度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度和反應(yīng)溫度4個(gè)變量參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)方法的特異性、靈敏度、重現(xiàn)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　2.建立完整的LAMP檢測(cè)系統(tǒng)——包括優(yōu)化后的LAMP方法和根據(jù)本方法研制的副溶血性弧菌核酸檢測(cè)試劑盒以及Deaou-308℃恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀，利用該檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)1株副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、50株副溶血性弧菌野生菌株、8株副溶血性弧菌近源菌株以及40份加標(biāo)海產(chǎn)品樣品（包括加工海鮮食品、

6、魚類、貝類等樣品）進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)LAMP檢測(cè)系統(tǒng)的特異性和靈敏度。
　　結(jié)果:
　　1.建立并優(yōu)化的LAMP檢測(cè)方法反應(yīng)體系為:內(nèi)引物(FIP、BIP)各1.6μmol/L，外引物(F3、B3)各0.2μmol/L，環(huán)引物(LF、LB)各0.8μmol/L，6mmol/LMg2+，8UBst大片斷DNA聚合酶，1.6mmol/LdNTP，0.2μmol/LSYTO-9，DNA模板200ng，反應(yīng)溫度:63℃，反應(yīng)時(shí)間:45m

7、in。
　　2.特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本方法對(duì)副溶血性弧菌檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性;對(duì)6株副溶血性弧菌近源菌株、14株常見的其他致病菌株檢測(cè)結(jié)果均為陰性，方法特異性良好。
　　3.靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本方法對(duì)副溶血性弧菌純培養(yǎng)物的靈敏度為103CFU/mL，副溶血性弧菌質(zhì)粒DNA靈敏度可達(dá)1fg/μl。
　　4.重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本方法對(duì)副溶血性弧菌質(zhì)粒DNA檢出限以上濃度重復(fù)20次檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，對(duì)陰性樣品重復(fù)20次檢測(cè)結(jié)

8、果均為陰性，重現(xiàn)性良好。
　　5.LAMP檢測(cè)系統(tǒng)（包括優(yōu)化后的LAMP方法和根據(jù)本方法研制的副溶血性弧菌核酸檢測(cè)試劑盒以及Deaou-308℃恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀）的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)1株副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和50株副溶血性弧菌野生菌株檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，對(duì)8株副溶血性弧菌近源菌株檢測(cè)結(jié)果均為陰性，特異性良好。
　　6.LAMP檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)40份加標(biāo)海產(chǎn)品樣品（包括加工海鮮食品、魚類、貝類等樣品）的檢測(cè)靈敏

9、度均可達(dá)到103CFU/mL。
　　結(jié)論:
　　1.針對(duì)副溶血性弧菌的tlh基因建立并優(yōu)化的LAMP快速檢測(cè)方法具有方便快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，為副溶血性弧菌的快速檢測(cè)提供了新的發(fā)展方向。
　　2.建立了海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的LAMP檢測(cè)系統(tǒng)（包括優(yōu)化后的LAMP方法、副溶血性弧菌核酸檢測(cè)試劑盒以及Deaou-308℃恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀），該檢測(cè)系統(tǒng)方便快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高，適用于海產(chǎn)品中副溶血性弧菌