SARS冠狀病毒全基因測(cè)定、結(jié)構(gòu)蛋白基因克隆、表達(dá)及相關(guān)研究.pdf

1、嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)是一種新現(xiàn)的主要經(jīng)呼吸道傳播的嚴(yán)重傳染病，它的疾病特點(diǎn)很多還不為人知。我們利用分子生物學(xué)的方法，研究SARS冠狀病毒(SARS-CoV)對(duì)不同組織的感染情況，并了解SARS流行初期病毒株的基因組序列。從感染SARS病毒而死亡的3例早期患者的不同組織中，用TRIzolRNA抽提試劑提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后用SARS-CoV不同基因區(qū)間的特定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)其中1例患者肺組織中病毒株的全序

2、列進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示有2例患者僅在肺組織中擴(kuò)增到病毒序列，另1例患者除在肺組織中檢測(cè)到病毒外，還在氣管、腎、淋巴結(jié)及肝組織中檢測(cè)到了病毒的存在。研究結(jié)果進(jìn)一步說明SARS-CoV具有多組織嗜性，這對(duì)研究SARS-CoV感染機(jī)體細(xì)胞的受體提供線索。病毒全序列分析結(jié)果顯示，該序列全長為29760堿基，具有典型的冠狀病毒序列特征，除具有RNA聚合酶基因和S、E、M和N四種結(jié)構(gòu)蛋白基因外，還有另外8個(gè)蛋白編碼框。經(jīng)與GenBank上登錄的其它

3、SARS-CoV全序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列除存在少量的SNP外，還多出一段29個(gè)核苷酸序列，這段序列的存在完全改變了ORF10和ORF11兩個(gè)蛋白編碼框，使得在此終止的蛋白翻譯能夠繼續(xù)進(jìn)行下去，從而使ORF10和ORF11兩個(gè)讀框合成為一個(gè)讀框。這一結(jié)果可能提示該序列有可能是病毒從動(dòng)物傳到人的原始序列。 為了充分認(rèn)識(shí)SARS的本質(zhì)，獲得更多關(guān)于SARS-CoV的免疫致病機(jī)理的信息，我室開始構(gòu)建SARS-CoV主要結(jié)構(gòu)蛋白原核表達(dá)

4、載體，并探討各結(jié)構(gòu)蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)情況及其抗原性。從SARS病人組織中抽提出RNA，經(jīng)RT-PCR獲得了SARS冠狀病毒刺突蛋白(S)、核衣殼蛋白(N)和膜蛋白(M)基因，將S基因的兩個(gè)區(qū)段、N基因和M基因分別克隆至表達(dá)載體pET-32和pET-28上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)情況，并通過WB鑒定表達(dá)蛋白的抗原性。結(jié)果我們成功構(gòu)建了SARS-CoV重組Ⅰ蛋白的表達(dá)載

5、體pET32-S1、pET32-S2、pET32-N、pET32-M、pET28-S1、pET28-S2和pET28-N；IPTG誘導(dǎo)N蛋白表達(dá)量最高，S2蛋白表達(dá)量次之，S1蛋白和M蛋白表達(dá)不明顯。這提示我們SARS病毒的N蛋白較容易在原核細(xì)胞中表達(dá)，而S蛋白和M蛋白可能由于有較多的半胱氨酸或跨膜區(qū)而不易在體外表達(dá)。通過進(jìn)行WB和其它單位對(duì)我室構(gòu)建質(zhì)粒的開發(fā)應(yīng)用鑒定發(fā)現(xiàn)N蛋白和S蛋白均有較好的抗原性，前者更適用于SARS的早期診斷。

6、 我們采用ELISA法檢測(cè)23例SARS患者發(fā)病后6個(gè)月、12個(gè)月兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清中SARS-IgG滴度。并以單克隆抗體標(biāo)記23例病人的PBMC，流式細(xì)胞儀檢測(cè)HLA-A2的陽性率。6個(gè)月時(shí)IgG抗體滴度的最高值為1：160陽性(4/23)，最低值為1：10陰性(1/23)，平均滴度為1：57；12個(gè)月時(shí)IgG抗體的最高滴度僅為1：80陽性(6/23)，最低值為1：10陰性(2/23)，平均滴度為1：27，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的抗體滴度之間的

7、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。結(jié)合李綱教授的報(bào)道，結(jié)果提示SARS恢復(fù)期病人的抗體滴度在發(fā)病6個(gè)月以后已呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，這增加了SARS感染后體液免疫的資料，并且支持目前所依據(jù)的SARS-IgG抗體診斷標(biāo)準(zhǔn)是合理可行的。23例患者中HLA-A2陽性14例，陽性率60.9％，可推測(cè)HLA-A2抗原肽疫苗可以治療和預(yù)防50％左右的SARS病毒感染。 SARS是一種新現(xiàn)的具有較高的傳染性和致死率的嚴(yán)重危及人類健康的疾病，在治

8、療上目前沒有特異性的藥物，而用于治療的激素類和干擾素表現(xiàn)出較多的不良反應(yīng)，因此對(duì)于SARS的防治重在早期診斷、早期隔離、對(duì)被認(rèn)為高危的人群盡早進(jìn)行免疫接種。隨著全球首個(gè)滅活SARS疫苗在我國順利完成Ⅰ期臨床試驗(yàn)，社會(huì)上對(duì)于SARS疫苗的接種熱情又被重新燃起。盡管人們確實(shí)有理由為人類最終邁出戰(zhàn)勝SARS而歡欣鼓舞，但專家提示說，SARS疫苗研制的真正成功尚有待時(shí)日。由于滅活疫苗、減毒疫苗都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，研發(fā)安全、有效、簡單、經(jīng)濟(jì)的基因工

9、程疫苗成為眾多國內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)的主要工作。目前，我們開展的工作主要是英國牛津大學(xué)同我科進(jìn)行SARS領(lǐng)域的合作項(xiàng)目，對(duì)于SARS-CoV相關(guān)CTL表位(肽)的系列研究，目的主要是針對(duì)SARS理想的合成肽疫苗的研發(fā)，也是深入了解SARS-CoV致病性的一個(gè)重要手段。在國內(nèi)外已經(jīng)見到一些這方面的研究，我們研究的不同之處在于：1、通過overlapping設(shè)計(jì)合成了2000多條肽，每一條肽15-mers，覆蓋了整個(gè)SARS-CoV基因組全長，通過

10、這種設(shè)計(jì)篩選出來的肽，比通過計(jì)算機(jī)模擬的合成肽，更具代表性。2、所選擇的調(diào)查樣本包括對(duì)照共計(jì)300多個(gè)，并且均需重復(fù)采血驗(yàn)證，具有廣泛性。3、工作程序：首先通過Elispot技術(shù)，鑒定各合成肽對(duì)PBMC的刺激反應(yīng)，篩出一Ⅱ些能夠活化PBMC的陽性多肽；為使其更接近CTL表位的8～10肽，進(jìn)一步縮短陽性多肽長度，并制成Tetramer，并通過流式細(xì)胞儀鑒定相關(guān)表位對(duì)CTL的活化能力影響。第一部分工作，已經(jīng)基本結(jié)束，取得了比較理想的結(jié)果，篩