棉花(Gossypium Hirsutum)水孔蛋白基因克隆、表達(dá)及功能研究.pdf

1、棉纖維是世界上重要的紡織原料。纖維細(xì)胞是由胚珠外表皮細(xì)胞分化而來(lái)的不分枝的單細(xì)胞毛狀突起，其生長(zhǎng)發(fā)育可分為四個(gè)發(fā)育階段：纖維起始、伸長(zhǎng)、次生壁合成及脫水成熟。棉纖維細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)制研究一直備受關(guān)注，近年來(lái)已經(jīng)分離克隆了大量纖維發(fā)育相關(guān)基因，并對(duì)其中一些基因的功能進(jìn)行了較為深入的研究。但是，有關(guān)纖維發(fā)育過(guò)程中水分運(yùn)輸及其調(diào)控機(jī)制的研究，仍較少有報(bào)道。水孔蛋白是存在于生物膜上的一類古老的通道蛋白，介導(dǎo)水分快速跨膜運(yùn)輸，在植物整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育和

2、環(huán)境應(yīng)答過(guò)程中都起著重要作用。為研究水孔蛋白在棉花中的功能，尤其是在棉纖維細(xì)胞發(fā)育及逆境應(yīng)答過(guò)程中的作用，我們從棉花中分離克隆了10多個(gè)水孔蛋白基因（包括12個(gè)質(zhì)膜內(nèi)在蛋白基因和1個(gè)液泡膜內(nèi)在蛋白基因），并對(duì)這些基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控及其編碼蛋白的活性、細(xì)胞亞定位和功能進(jìn)行了研究。取得如下研究結(jié)果： 1.從棉花cDNA文庫(kù)中分離克隆了12個(gè)編碼質(zhì)膜內(nèi)在蛋白基因的cDNA，通過(guò)序列比較和進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)其中4個(gè)屬于PIP1亞類基因，依次

3、命名為GhPIP1；1，GhPIP1；3，GhPIP1；4GhPIP1；5；另外8個(gè)屬于PIP2亞類，依次以GhPIP2；1～GhPIP2；8命名。同時(shí)，利用PCR技術(shù)，從棉花基因組中克隆了7個(gè)GhPIP基因的全長(zhǎng)序列，與cDNA序列比較分析發(fā)現(xiàn)，其中5個(gè)基因（GhPIP1；5，GhPIP2；3，GhPIP2；4，GhPIP2；7，GhPIP2；8）由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，而GhPIP1；3和GhPIP2；6基因只含有2個(gè)內(nèi)含子。

4、所有基因的內(nèi)含子插入的位置高度保守。 2.蛋白活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，所檢測(cè)的9個(gè)GhPIP蛋白都具有水通道活性，其中3個(gè)GhPIP1蛋白的活性較低，而GhPIP2都具有較高的活性。GhPIP2；3和GhPIP2；4活性最高，它們都對(duì)汞離子敏感。 3.利用GFP熒光蛋白共定位技術(shù)研究了GhPIP蛋白的細(xì)胞亞定位。構(gòu)建了GhPIP1；4和GhPIP2；4基因與eGFP的融合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化棉花，獲得表達(dá)GFP熒光蛋白的轉(zhuǎn)化愈傷組織，激

5、光共聚焦顯微鏡觀察表明，這兩個(gè)蛋白均定位在細(xì)胞質(zhì)膜上。 4.GhPIP基因在棉花中的表達(dá)具有組織差異性，其中4個(gè)基因（GhPIP2；3～GhPIP2；6）在纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，并受纖維發(fā)育調(diào)控，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物主要集中在伸長(zhǎng)期的棉纖維中。利用水孔蛋白的活性抑制劑--HgCl2處理棉花離體胚發(fā)現(xiàn)，HgCl2能顯著抑制纖維細(xì)胞的伸長(zhǎng)，纖維長(zhǎng)度明顯下降；而用HgCl2和HgCl2的抑制劑--β-巰基乙醇同時(shí)處理棉花離體胚，纖維長(zhǎng)度比HgCl2單

6、獨(dú)處理時(shí)有所恢復(fù)。另外，在酵母中異源表達(dá)GhPIP2；3等基因能促使宿主細(xì)胞異常的縱向伸長(zhǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)度是對(duì)照的1.30～2.18倍。以上結(jié)果表明，GhPIP2；3等4個(gè)GhPIP2基因在棉纖維伸長(zhǎng)過(guò)程中起重要作用。 5.GhPIP1；3基因在6～15 DPA胚珠中特異表達(dá)，在9 DPA胚珠中表達(dá)量達(dá)到最大值。開(kāi)花后6～15天是胚珠質(zhì)量增長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，這表明GhPIP1；3可能在棉花胚珠快速增長(zhǎng)的過(guò)程中起作用。利用分子克隆技術(shù)和農(nóng)桿菌

7、介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建了GhPIP1；3基因的RNAi載體并轉(zhuǎn)化棉花，目前已得到了來(lái)自5個(gè)胚細(xì)胞系的13棵轉(zhuǎn)基因棉花植株，有關(guān)分析正在進(jìn)行中。 6.除上述5個(gè)基因以及GhPIP2；7外，其余6個(gè)GhPIP基因均在根中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。Northern雜交和實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示GhPIP1；1，GhPIP2；1，GhPIP2；2主要在幼嫩的根（3天）中表達(dá)，而在較成熟的根中（6～14天），其表達(dá)量顯著下降；另外，這3個(gè)基因在不