棉花(Gossypium hirsutum)DREB-CBF基因的篩選鑒定及其在植物抗逆應(yīng)答中的功能研究.pdf

1、棉花是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，但隨著全球生態(tài)環(huán)境的日益惡化，干旱、鹽漬、低溫等非生物脅迫常常對(duì)棉花生產(chǎn)造成重大損失，是限制棉花產(chǎn)量增加的主要環(huán)境因素。為解決這一農(nóng)業(yè)問(wèn)題，通過(guò)基因工程手段，發(fā)掘棉花抗逆相關(guān)的重要功能基因，并將這些基因?qū)胫参锘蚪M，進(jìn)而獲得抗逆新品種，是應(yīng)對(duì)逆境脅迫，提高棉花產(chǎn)量的最為有效途徑之一。研宄表明，過(guò)量表達(dá)特定的脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控下游多個(gè)抗逆功能基因的表達(dá)，對(duì)于提高作物抗逆性具有重要作用。
　

2、　DREB/CBF(Dehydration Responsive Element Binding Protein/C-repeat Binding Factor)是一類(lèi)重要的植物轉(zhuǎn)錄因子，在植物響應(yīng)逆境脅迫應(yīng)答以及抗逆過(guò)程中扮演重要角色。與擬南芥和水稻等傳統(tǒng)模式植物相比，棉花抗逆性轉(zhuǎn)錄因子的鑒定和抗逆機(jī)制的研究還比較少。因此，篩選和鑒定棉花抗逆相關(guān)的DREB/CBF基因，分析揭示其抗逆分子機(jī)制，通過(guò)基因工程手段來(lái)改良提高棉花的抗逆性，對(duì)

3、于我國(guó)棉花生產(chǎn)具有重要意義。本文運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)棉花DREB/CBF基因進(jìn)行篩選鑒定，分析這些基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、進(jìn)化關(guān)系以及干旱誘導(dǎo)表達(dá)模式，通過(guò)過(guò)量表達(dá)方法對(duì)棉花CBF2和CBF3基因在植物非生物脅迫應(yīng)答過(guò)程中的功能及作用機(jī)制進(jìn)行了研究，獲得了如下主要結(jié)果:
　　1.參與非生物脅迫應(yīng)答棉花DREB/CBF基因的分離、鑒定和表達(dá)分析
　　通過(guò)Blast同源搜索，共鑒定出21個(gè)棉花CBF基因家族成員，從基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化等方面進(jìn)

4、行了分析。結(jié)果表明，與擬南芥和水稻CBF基因一樣，棉花CBF家族基因均含有一段由58個(gè)氨基酸組成的保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域。根據(jù)進(jìn)化關(guān)系，將所分離鑒定的21個(gè)棉花CBF基因劃分為4個(gè)亞族(Ⅰ-Ⅳ)。同時(shí)，利用半定量RT-PCR和熒光定量RT-PCR方法對(duì)這21個(gè)棉花CBF基因在冷、干旱（甘露醇處理）和鹽脅迫處理下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在受到冷脅迫誘導(dǎo)時(shí)，有12個(gè)基因的表達(dá)量顯著上調(diào);在受到干旱脅迫誘導(dǎo)時(shí)，有10個(gè)基因

5、的表達(dá)量顯著上調(diào);而在受到鹽脅迫脅迫誘導(dǎo)時(shí)，則有11個(gè)基因表達(dá)量顯著上調(diào)。但每個(gè)基因在受到脅迫誘導(dǎo)后的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)量均有所不同。
　　2.GhCBF3基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)分析
　　根據(jù)棉花CBF基因逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)模式，從候選基因中篩選了一個(gè)受干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)高表達(dá)的基因。序列分析表明，該基因無(wú)內(nèi)含子，開(kāi)放閱讀框?yàn)?62bp，編碼153個(gè)氨基酸，我們將其命名為GhCBF3(GeneBank號(hào)為KP780186)。進(jìn)一步的表達(dá)分析

6、結(jié)果表明經(jīng)NaCl、甘露醇和ABA處理后，GhCBF3基因表達(dá)量均顯著上升，且在棉花子葉和根中該基因表達(dá)量最高。對(duì)GhCBF3蛋白亞細(xì)胞定位分析表明，GhCBF3∶eGFP綠色熒光信號(hào)主要在細(xì)胞核中檢測(cè)到，說(shuō)明GhCBF3可能是在細(xì)胞核中發(fā)揮調(diào)控功能。但自激活分析表明GhCBF3蛋白不具有自激活現(xiàn)象。在GhCBF3基因的啟動(dòng)子序列區(qū)域含有多個(gè)響應(yīng)ABA信號(hào)的順式作用元件AREB，利用GUS報(bào)告基因研究該啟動(dòng)子的表達(dá)活性。GUS活性的組織

7、化學(xué)分析結(jié)果顯示，在正常條件下，在GhCBF3啟動(dòng)子控制下，轉(zhuǎn)基因擬南芥子葉、葉片的葉脈、根尖，尤其在氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中都檢測(cè)到GUS信號(hào)。擬南芥幼苗經(jīng)非生物脅迫處理后，GUS活性增強(qiáng)，表明GhCBF3啟動(dòng)子能響應(yīng)高鹽、干旱和ABA等外界環(huán)境信號(hào)。
　　3.GhCBF3基因的抗逆功能分析
　　為研究GhCBF3基因的功能，構(gòu)建了GhCBF3過(guò)量表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化了擬南芥，篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株。分別選取這些外源基因在擬南芥中表達(dá)量高、中

8、、低的株系做表型分析及功能研究。結(jié)果顯示過(guò)量表達(dá)GhCBF3基因的轉(zhuǎn)基因植株在生長(zhǎng)表型上與野生型對(duì)照植株沒(méi)有明顯差異。當(dāng)受到干旱和鹽脅迫處理后，轉(zhuǎn)GhCBF3基因擬南芥對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性比對(duì)照顯著增強(qiáng)。另外，GhCBF3過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株顯著提高了對(duì)外源ABA的敏感性。在受到高鹽、干旱和ABA處理后，轉(zhuǎn)基因擬南芥中與干旱脅迫和ABA相關(guān)的RD29A、COR15A、RD22及P5CS基因表達(dá)量顯著上調(diào)。GhCBF3基因除了能提高轉(zhuǎn)基因

9、擬南芥種子對(duì)ABA敏感性外，同時(shí)也會(huì)促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中氣孔關(guān)閉。另外，當(dāng)受到外源ABA處理后，轉(zhuǎn)基因擬南芥中AREB1/ABF2和AREB2/ABF4基因的表達(dá)量顯著高于野生型，這說(shuō)明GhCBF3基因能夠調(diào)控轉(zhuǎn)基因擬南芥中AREB1/ABF2和AREB2/ABF4基因的表達(dá)，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)基因擬南芥氣孔對(duì)ABA的敏感性，加速氣孔關(guān)閉，從而提高植株抗旱能力。上述結(jié)果表明GhCBF3參與了對(duì)ABA的應(yīng)答。
　　4.GhCBF2基因的表

10、達(dá)和抗逆功能分析
　　從棉花中鑒定了另外一個(gè)CBF基因，命名為GhCBF2。該基因編碼一段長(zhǎng)度為226個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)序列。GhCBF2含有1個(gè)典型的由58個(gè)氨基酸組成的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可形成3個(gè)β-折疊和1個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)。分析表明，GhCBF2基因在根和葉片組織中表達(dá)量最高。經(jīng)NaCl和甘露醇處理后，GhCBF2基因在棉花子葉、根和葉片中的表達(dá)量均顯著增加;當(dāng)受到ABA處理后GhCBF2基因在各組織中的表達(dá)量顯

11、著增加，表明GhCBF2基因在棉花應(yīng)對(duì)干旱和鹽脅迫時(shí)可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。GhCBF2蛋白亞細(xì)胞定位分析表明，GhCBF2∶eGFP綠色熒光信號(hào)主要集中在細(xì)胞核中，說(shuō)明GhCBF2蛋白定位在細(xì)胞核中。為分析GhCBF2基因的功能，分別從GhCBF2轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中選擇了L6，L11和L21，來(lái)分別代表高、中和低3種目的基因表達(dá)量不同的轉(zhuǎn)基因株系，用于基因功能分析。結(jié)果證實(shí)GhCBF2基因高表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系具有最強(qiáng)的抗鹽、抗旱能力，說(shuō)明

12、GhCBF2基因在增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物種子和幼苗時(shí)期的耐鹽和抗旱性方面發(fā)揮重要作用。
　　本實(shí)驗(yàn)中對(duì)GhCBF2轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型植株中游離脯氮酸、相對(duì)含水量和葉綠體色素的含量等一系列生理指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果顯示，當(dāng)轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型經(jīng)NaCl溶液處理和干旱處理后，野生型擬南芥葉片中相對(duì)含水量和葉綠體色素的含量比轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中下降更顯著，但是游離脯氨酸含量卻少于轉(zhuǎn)基因擬南芥，表明轉(zhuǎn)GhCBF2基因擬南芥對(duì)鹽和干旱脅迫均具有更強(qiáng)的耐受性