果蠅嗅覺基因的篩選、鑒定及其功能的研究.pdf

1、果蠅嗅覺系統(tǒng)的特點及相應(yīng)技術(shù)的獨特結(jié)合，使果蠅成為研究嗅覺的理想模式系統(tǒng)。本文采用SG18.1-Gal4/UAS基因篩選系統(tǒng)對改變果蠅嗅覺發(fā)育的基因進(jìn)行了大規(guī)模篩選，并對分離到的Akap200進(jìn)行了功能鑒定，旨在通過對果蠅嗅覺系統(tǒng)的異位表達(dá)篩選，揭示作用于嗅覺神經(jīng)的基因，為研究其功能提供大量有意義的資源。在果蠅S2細(xì)胞上對通過調(diào)節(jié)基因篩選獲得的nrg基因功能進(jìn)行了研究，并對nrg和limk基因相互作用的分子機(jī)制進(jìn)行了探索。主要內(nèi)容包括：

2、 1.本文首次利用SG18.1-Gal4/UAS基因篩選系統(tǒng)對果蠅嗅覺基因進(jìn)行了篩選和鑒定：結(jié)果表明，所采用的方法可以快速、有效地分離到果蠅嗅覺相關(guān)基因；從1515株果蠅P{GS｝品系分離到86株突變體，其中40株有明顯表型，從中鑒定了23個基因，這些基因在ORN強(qiáng)迫表達(dá)時可以損壞果蠅嗅葉的固有結(jié)構(gòu)：在篩選中發(fā)現(xiàn)的一些調(diào)節(jié)嗅覺圖譜發(fā)育的基因可以編碼新蛋白或編碼參與軸突生長和細(xì)胞骨架重塑的蛋白；為了便于研究，根據(jù)基因的功能和所編碼

3、蛋白的特點，我們對分離到的基因進(jìn)行了分類，即參與軸突引導(dǎo)和突觸產(chǎn)生、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架和功能未確定或未知的基因；并通過對嗅覺感覺器的檢測發(fā)現(xiàn)，除了調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的基因外，其他基因?qū)τ|覺器的數(shù)量和分布影響不明顯。 2.首次分析了Akap200基因?qū)壭嵊X發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)Akap200可以使嗅小球發(fā)生融合，然而缺失Akap200可導(dǎo)致嗅小球的形態(tài)改變或出現(xiàn)異常的嗅小球，而且會影響ORN的正確定位過程。 3.構(gòu)建了果蠅

4、nrg基因細(xì)胞內(nèi)片段真核表達(dá)載體：根據(jù)nrg180基因的DNA序列設(shè)計合成了一對特異性引物，擴(kuò)增出了含有整個nrg180基因細(xì)胞內(nèi)片段的序列，通過序列鑒定后，應(yīng)用T/A克隆和亞克隆成功地構(gòu)建了S2細(xì)胞表達(dá)載體pRmHa3-nrg180-Cd，為研究nrg180基因細(xì)胞內(nèi)片段功能打下了基礎(chǔ)。 4.利用果蠅S2細(xì)胞對Nrg蛋白的特性進(jìn)行了研究：應(yīng)用陽性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將不同的Nrg蛋白形式轉(zhuǎn)染到果蠅S2細(xì)胞并成功地獲得了表達(dá)，優(yōu)化的轉(zhuǎn)

5、染條件為DNA和脂質(zhì)體的比例為2：15(μg/μl)，轉(zhuǎn)染時間36h，0.7mMCuSO4誘導(dǎo)20h，在優(yōu)化的條件下最高轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到20％；細(xì)胞集合和定量分析試驗顯示，Nrg180和NrgGPI的表達(dá)可以快速誘導(dǎo)細(xì)胞集合反應(yīng)而Nrg180-Cd的表達(dá)不參與細(xì)胞的吸附反應(yīng)；Nrg180和NrgGPI的細(xì)胞集合在前2h內(nèi)最明顯并與對照和Nrg180-Cd的差異極顯著(P＜0.01)，進(jìn)行8h時誘導(dǎo)細(xì)胞的集合最高可達(dá)22.2％和16.6％

6、;通過熒光染色發(fā)現(xiàn)，Nrg蛋白在S2細(xì)胞的膜上表達(dá)并誘導(dǎo)同源吸附反應(yīng)。 5.果蠅Limk基因在S2細(xì)胞中的表達(dá)及其對nrg功能的影響：本試驗通過兩步克隆法首次構(gòu)建了Limk基因的S2細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pRmHa3-Limk-myc，而且該重組質(zhì)粒在S2細(xì)胞中獲得了高效表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)Limk蛋白在S2細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分布均勻，不影響細(xì)胞的形態(tài)，不引起S2細(xì)胞的相互吸附現(xiàn)象；細(xì)胞集合試驗證明，在S2細(xì)胞上共轉(zhuǎn)染Limk和Nrg180重組質(zhì)粒時Lim

7、k蛋白通過作用于nrg基因細(xì)胞內(nèi)片段進(jìn)而影響Nrg180引起的細(xì)胞集合，主要表現(xiàn)在增強(qiáng)S2細(xì)胞相互吸附的強(qiáng)度，其次是集合細(xì)胞的數(shù)量；同時對共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞雙重?zé)晒馊旧珪r發(fā)現(xiàn)，Limk蛋白不在細(xì)胞質(zhì)而主要集中在細(xì)胞膜上，而且和Nrg蛋白的分布基本一致，表示Nrg蛋白對Limk蛋白的分布有重要影響。 6.雙鏈RNAi法沉默Limk基因?qū)rg誘導(dǎo)細(xì)胞集合的影響：RNAi技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種研究基因功能的的重要手段之一。本試驗首先根

8、據(jù)LimkcDNA激酶區(qū)序列設(shè)計合成了一對引物，應(yīng)用RT-PCR對內(nèi)源性Limk基因是否在S2細(xì)胞表達(dá)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)S2細(xì)胞中含有內(nèi)源性LimkRNA;再應(yīng)用RT-PCR和熒光染色檢測dsRNAi對Limk基因表達(dá)的作用，發(fā)現(xiàn)dsRNAi可以大量地抑制S2細(xì)胞內(nèi)源性Limk基因的轉(zhuǎn)錄，也可以特異性沉默外源Limk基因在S2細(xì)胞中的表達(dá)，表明本實驗建立的雙鏈RNA干擾法是可行的；最后通過細(xì)胞集合和細(xì)胞計數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，dsRNAi沉默Lim