單核細(xì)胞增生李斯特菌毒力相關(guān)基因的篩選鑒定及其功能研究.pdf

1、據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)于2015年統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，全球每年發(fā)生食源性疾病的病例數(shù)超過60億人次，平均每10個(gè)人中就有一例感染，導(dǎo)致42萬人死亡，食源性疾病已成為當(dāng)今世界重大的公共衛(wèi)生問題。由單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)、沙門菌（Salmonella spp.）和大腸桿菌(Escherichia coli)等病原細(xì)菌引起的食源性疾病是影響食品安全的最主要的因素之一。其中Lm引起的李斯特菌病具有

2、高致死率的特點(diǎn)，早在2000年就已被WHO列入重點(diǎn)檢測(cè)的食源性致病菌之一。Lm作為兼性胞內(nèi)寄生的革蘭陽性桿菌，在自然環(huán)境中廣泛分布，隨被污染的食物進(jìn)入腸道后，可引發(fā)胃腸炎、腦膜炎、流產(chǎn)等臨床癥狀。深入研究Lm的致病機(jī)理，獲得與致病性相關(guān)的毒力因子和分子標(biāo)識(shí)，對(duì)李斯特菌病的預(yù)防控制具有重要的意義。
　　Lm體內(nèi)致病相關(guān)毒力基因的挖掘及功能研究是揭示其致病機(jī)制的有效方法，其與宿主細(xì)胞相互作用的過程中，能根據(jù)所遇到的不同生境，隨時(shí)調(diào)整多

3、個(gè)毒力基因的表達(dá)模式，從而使細(xì)菌可在宿主中適應(yīng)性生存。由于病原菌與宿主互作是一個(gè)多因子作用的復(fù)雜過程，目前對(duì)其致病性的研究已逐漸從過去對(duì)單個(gè)基因的功能研究，轉(zhuǎn)變?yōu)閺恼w水平分析宿主和病原菌的相互作用。而轉(zhuǎn)座突變技術(shù)已成為發(fā)現(xiàn)新基因、發(fā)掘已知基因新功能的有效途徑之一，有利于我們開展高通量地體內(nèi)致病毒力基因的篩選。
　　本研究對(duì)強(qiáng)毒株Lm XYSN進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析，對(duì)毒力調(diào)控因子PrfA特有氨基酸突變以及新基因組島8的功能進(jìn)行了

4、探究;另外，利用轉(zhuǎn)座突變技術(shù)建立Lm XYSN突變體文庫(kù)，以人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞為篩選模型，進(jìn)行毒力相關(guān)基因的全基因組水平高通量篩選、鑒定與功能研究。Lm XYSN毒力相關(guān)基因的挖掘及功能的解析，有利于揭示其在宿主體內(nèi)適應(yīng)生存的機(jī)制，為李斯特菌病的預(yù)防與控制奠定理論基礎(chǔ)。
　　1、Lm XYSN PrfA氨基酸替換突變株的構(gòu)建及生物學(xué)特性研究
　　對(duì)31株李斯特菌毒力調(diào)控因子PrfA的比較分析顯示，Lm XYSN PrfA蛋白存

5、在兩處氨基酸自然突變Lys10Asn以及Thr151Ala。利用PyMOL軟件對(duì)突變位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)位于第10位氨基酸突變改變了蛋白表面的電子分布，而第151位氨基酸突變位點(diǎn)則是位于PrfA變構(gòu)活化熱點(diǎn)區(qū)。由此提示，毒力調(diào)控因子PrfA氨基酸的自然突變可能影響到其調(diào)控作用，從而對(duì)Lm XYSN的體內(nèi)致病特性產(chǎn)生影響。
　　為了研究PrfA的自然突變對(duì)Lm XYSN毒力的影響，利用同源重組技術(shù)分別構(gòu)建了prfA缺失突變株L

6、m XYSN△prfA以及第10位和151位氨基酸突變回復(fù)菌株Lm XYSNPrfA10K/151T。生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果顯示，突變株及回復(fù)株在BHI培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力與野生菌株一致，氨基酸替換回復(fù)突變株的溶血活性也與野生株的相同。RT-PCR檢測(cè)細(xì)菌感染細(xì)胞過程中毒力島1(LIPI-1)中基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，結(jié)果顯示XYSN PrfA氨基酸突變后，其mRNA表達(dá)水平比野生株降低一倍，actA、hly、plcA以及mpl轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，

7、提示Lm XYSN PrfA的自然突變?cè)鰪?qiáng)了對(duì)LIPI-1中基因的調(diào)控能力。以非吞噬細(xì)胞系Caco-2 BBE以及HeLa細(xì)胞系為體外感染模型的測(cè)定結(jié)果表明，Lm XYSN PrfA氨基酸的自然突變顯著提高了細(xì)菌對(duì)Caco-2 BBE的增殖能力以及HeLa感染的黏附、侵襲以及增殖能力;而以小鼠口服感染測(cè)定的LD50結(jié)果表明，回復(fù)菌株Lm XYSN PrfA10K/151T毒力比野生株降低7.34倍。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Lm XYSN Pr

8、fA蛋白第10位和151位氨基酸突變提高了prfA自身轉(zhuǎn)錄水平以及對(duì)LIPI-1中基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，增強(qiáng)了Lm XYSN對(duì)非吞噬細(xì)胞的黏附侵襲能力，影響了細(xì)菌在宿主體內(nèi)的致病能力。
　　2、Lm XYSN基因組島8突變株的構(gòu)建及生物學(xué)特性研究
　　對(duì)基因組島8內(nèi)分布的基因比對(duì)分析，選擇與其它李斯特菌同源性較低的基因簇(XYSN_0819、XYSN_0820、XYSN_0821和XYSN_0822)進(jìn)行功能的初步研究。采用同

9、源重組技術(shù)對(duì)該基因簇進(jìn)行敲除，并對(duì)Lm XYSN△XYSN0819-0822不同條件下的生長(zhǎng)能力以及不同溫度下生物被膜的形成能力進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，突變株Lm XYSN△XYSN0819-0822在BHI培養(yǎng)基和MEM培養(yǎng)中生長(zhǎng)速率均顯著低于野生株(P＜0.05)，耐受1％ Triton的能力顯著弱于野生株(P＜0.05)，且在37℃和42℃形成生物被膜的能力也顯著下降(P＜0.05;P＜0.01)。
　　以細(xì)胞系Caco-2

10、BBE、HeLa為體外感染模型、BABL/c小鼠為體內(nèi)感染模型，對(duì)XYSN_0819-0822缺失株的侵襲能力、小鼠致病能力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，XYSN_0819-0822缺失對(duì)細(xì)菌侵襲Caco-2 BBE、HeLa細(xì)胞系的胞內(nèi)增殖能力造成顯著影響(P＜0.05)，并降低了對(duì)小鼠的致病力。上述研究結(jié)果表明，Lm XYSN基因組島8中XYSN_0819、XYSN_0820、XYSN_0821以及XYSN_0822構(gòu)成的基因簇參與該菌生長(zhǎng)代

11、謝、生物被膜形成和胞內(nèi)增殖，提高其在不利環(huán)境中的抵抗能力，促進(jìn)在宿主細(xì)胞中的適應(yīng)性生存。
　　3、Lm XYSN新毒力相關(guān)基因的篩選及功能研究
　　利用Mariner家族中的TnYLB-1轉(zhuǎn)座元件構(gòu)建了含有6000個(gè)Lm XYSN突變子的轉(zhuǎn)座突變體文庫(kù)，從中隨機(jī)挑取1127個(gè)突變子，以人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞系Caco-2 BBE建立突變子篩選模型進(jìn)行毒力相關(guān)基因的篩選，共獲得增殖能力下降5倍以上的突變株15株，其中包括降低20倍以

12、上的3株突變株。利用反向PCR(reverse PCR)和測(cè)序分析，對(duì)3株突變株的插入位點(diǎn)進(jìn)行了鑒定，它們的轉(zhuǎn)座插入位點(diǎn)分別位于XYSN_0462、XYSN_1095以及XYSN_1098中。其中XYSN_0462是已知的在感染非吞噬細(xì)胞中發(fā)揮重要作用的內(nèi)化素基因inlA，由此證明本研究采用的細(xì)胞模型篩選Lm XYSN毒力因子方法的可行性。
　　對(duì)XYSN_1095∷Tn和XYSN_1098∷Tn在BHI培養(yǎng)基中生長(zhǎng)能力測(cè)定結(jié)果顯

13、示，基因的插入失活對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)能力未造成明顯影響。通過掃描電子顯微鏡對(duì)細(xì)菌形態(tài)進(jìn)行觀察則發(fā)現(xiàn)，XYSN_1095∷Tn和XYSN_1098∷Tn的菌體變短且部分菌體發(fā)生彎曲。對(duì)Caco-2BBE的黏附、侵襲以及胞內(nèi)增殖能力進(jìn)行測(cè)定結(jié)果表明，XYSN_1095和XYSN_1098的基因突變，極顯著降低了細(xì)菌的侵襲與增殖能力。同時(shí)，對(duì)XYSN_1095∷Tn以及XYSN_1098∷Tn口服感染BABL/c小鼠LD50測(cè)定結(jié)果顯示，XYSN_