棉花(Gossypium hirsutum)藍(lán)銅蛋白BCP4在纖維細(xì)胞伸長中的功能研究.pdf

1、棉纖維作為一種天然紡織纖維，經(jīng)現(xiàn)代紡織技術(shù)加工成的服裝、家用棉制品等深受廣大消費(fèi)者的喜愛。但是，我國原有的棉花品種中，纖維品質(zhì)參差不齊，無法滿足市場對高產(chǎn)量、高品質(zhì)棉纖維的需求。從可持續(xù)發(fā)展角度看，改善棉纖維品質(zhì)迫在眉睫。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，通過克隆鑒定調(diào)控棉纖維發(fā)育的關(guān)鍵基因，研究棉纖維發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制，然后運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)較快獲得優(yōu)質(zhì)棉品種，是目前常用的一種研究思路和育種方法。
　　藍(lán)銅蛋白(Blue copper p

2、roteins，BCP)是一種Ⅰ型銅蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌中，其后發(fā)現(xiàn)BCP在生物界中廣泛分布。研究表明，BCP在生物體內(nèi)發(fā)揮重要功能，如電子傳遞、氧活化等。近來有研究表明，其對植物正常發(fā)育也起到重要的調(diào)控作用。GhBCP4(Genebank登錄號:GU451702.1)是我們從陸地棉(Gossypium hirsutum)中分離得到的一種藍(lán)銅蛋白，組織表達(dá)譜分析表明GhBCP4在開花后10天(10 days postanthesis，1

3、0DPA)的棉纖維中高度表達(dá)，暗示該基因在棉纖維伸長過程中可能發(fā)揮重要功能。擬南芥表皮毛與棉纖維（種皮毛）同屬植物表皮毛范疇，一些研究結(jié)果表明在擬南芥表皮毛中異源表達(dá)棉纖維發(fā)育相關(guān)的基因，有助于理解該基因在棉纖維發(fā)育過程中的生物學(xué)功能。
　　本文從蛋白亞細(xì)胞定位、啟動(dòng)子分離及元件分析、轉(zhuǎn)基因擬南芥和棉花的鑒定及表型分析等方面對GhBCP4在棉纖維伸長過程中的功能進(jìn)行了研究探討，主要結(jié)果如下:
　　1.GhBCP4蛋白亞細(xì)胞定

4、位分析
　　構(gòu)建了GhBCP4∷GF融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，然后利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移來進(jìn)行棉花遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化的棉花愈傷組織細(xì)胞。挑取有GFP熒光的棉花愈傷組織細(xì)胞制片，在共聚焦顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)GhBCP4蛋白不僅定位在細(xì)胞膜上，在細(xì)胞質(zhì)中也有分布。
　　2.GhBCP4啟動(dòng)子克隆鑒定
　　了解GhBCP4上游調(diào)控序列有助于GhBCP4的功能研究，因此，根據(jù)已公布的棉花基因組序列，設(shè)計(jì)引物，利

5、用PCR技術(shù)得到了GhBCP4的啟動(dòng)子序列。該序列長度為1985bp，通過PLACE和PlantCARE兩個(gè)在線啟動(dòng)子預(yù)測軟件進(jìn)行元件分析，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子除具有基本啟動(dòng)子特征元件之外，還具有參與生長發(fā)育、抗逆應(yīng)答等重要調(diào)控元件。
　　構(gòu)建了GhBCP4Pro∷GUS融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因植株。但是，對篩選得到的綠苗進(jìn)行GUS染色，結(jié)果沒有得到預(yù)期的顯藍(lán)信號，相關(guān)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　3.GhBCP4過量表達(dá)轉(zhuǎn)

6、基因擬南芥表型分析
　　構(gòu)建了GhBCP4過量表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因植株。對轉(zhuǎn)基因植株T2代純化株系進(jìn)行了GhBCP4基因表達(dá)量檢測和表型分析。提取T2代植株葉片RNA，檢測分析了不同轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中GhBCP4的表達(dá)量。選取表達(dá)量從高到低的3個(gè)株系，統(tǒng)計(jì)分析植株上第5/6/7片蓮座葉表皮毛長度和數(shù)目，結(jié)果表明，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥葉表皮毛增長增多，這說明GhBCP4過量表達(dá)能夠促進(jìn)表皮毛起始和發(fā)育。
　　

7、4.GhBCP4轉(zhuǎn)基因棉花鑒定及表型分析
　　1)CaV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GhBCP4 RNAi轉(zhuǎn)基因棉花表型分析對所獲得的GhBCP4 RNAi轉(zhuǎn)基因棉花及其后代植株(T0、T1和T2代)進(jìn)行鑒定，利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Quatitative Real time PCR，Q-RT PCR)技術(shù)檢測了轉(zhuǎn)基因棉花株系中GhBCP4基因的表達(dá)量，結(jié)果表明RNAi轉(zhuǎn)基因株系的棉纖維細(xì)胞中該基因的表達(dá)受到不同程度的抑制，其表達(dá)量顯著低于

8、野生型。而且，轉(zhuǎn)基因棉花纖維發(fā)育受阻，成熟纖維長度較野生型明顯變短。這說明GhBCP4基因在棉纖維發(fā)育中發(fā)揮重要調(diào)控作用。
　　2)RDL1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GhBCP4 RNAi的載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因棉花植株鑒定
　　為了更好地揭示GhBCP4在棉纖維發(fā)育中的功能，克隆了棉纖維特異啟動(dòng)子RDL1p，構(gòu)建RDL1p∷GhBCP4RNAi表達(dá)載體，用RDL1p驅(qū)動(dòng)GhBCP4在棉纖維中特異表達(dá)。目前已得到7個(gè)胚性愈傷組織細(xì)胞系，其中大部

9、分體細(xì)胞胚萌發(fā)出苗，獲得大量的轉(zhuǎn)基因棉花小苗(T0代)，移栽到大田中，生長發(fā)育至成熟。對這些轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了鑒定和初步分析。
　　3)CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GhBCP4過量表達(dá)(OE)轉(zhuǎn)基因棉花植株鑒定除在擬南芥表皮毛中過量表達(dá)GhBCP4外，也構(gòu)建了GhBCP4過量表達(dá)載體，進(jìn)行棉花遺傳轉(zhuǎn)化，獲得大量T0代轉(zhuǎn)基因棉花植株，大多數(shù)植株生長發(fā)育正常。提取其基因組DNA，進(jìn)行陽性鑒定，表明其中大多為陽性植株。這些轉(zhuǎn)基因棉花的表型分