磷脂酶GhPLA2α和GhPLA2β在棉花纖維細(xì)胞發(fā)育中的功能.pdf

1、棉花是世界上重要的天然纖維作物。棉纖維長度可達(dá)60mm，成熟纖維長徑比可達(dá)到1000～3000，其干重的90％以上由纖維素構(gòu)成。所以棉纖維是高等植物中長徑比最大、纖維素含量最高的單細(xì)胞。因此，棉花是研究細(xì)胞分化、伸長、以及纖維素合成的理想模型。
　　棉纖維細(xì)胞發(fā)育經(jīng)歷了4個(gè)連續(xù)的階段:起始、伸長、次生壁沉積和成熟。在這個(gè)過程中,纖維細(xì)胞的快速伸長伴隨著膜脂含量的增加和重構(gòu)，對結(jié)構(gòu)物質(zhì)諸如磷脂、蛋白質(zhì)等需求量很大。
　　磷脂酶

2、A2(PLA2)催化水解磷脂的sn-2位?；⑴c細(xì)胞膜的重構(gòu)。分泌型磷脂酶A2(sPLA2)是PLA2的一個(gè)亞類。研究表明，sPLA2β在促進(jìn)細(xì)胞伸長方面起著重要的作用。此外，sPLA2β催化水解的產(chǎn)物溶血磷脂和游離脂肪酸作為信號分子參與了細(xì)胞發(fā)育調(diào)控。然而，sPLA2在棉花纖維發(fā)育中的作用機(jī)制尚不清楚。因此，有必要對sPLA2在棉花纖維發(fā)育中的功能作進(jìn)一步的研究。在棉花纖維突起時(shí)，檢測到GhPLA2α亞型編碼基因在纖維細(xì)胞中的表達(dá)水

3、平明顯高于胚珠表皮的非纖維細(xì)胞，推測該基因參與了棉花纖維細(xì)胞的發(fā)育。進(jìn)而，克隆了sPLA2的兩個(gè)亞型GhPLA2α和GhPLA2β，研究其表達(dá)模式和活性，并在胚珠外表皮中上或下調(diào)目的基因的表達(dá)來探索它們對棉纖維細(xì)胞發(fā)育的功能。主要研究結(jié)果如下:
　　1.磷脂酶抑制劑阻礙纖維伸長
　　磷脂酶PLA2抑制劑ONO-RS-082、HELSS和ETYA離體條件下處理-1 dpa的棉花胚珠。觀察纖維發(fā)育的結(jié)果表明，不同濃度抑制劑均對纖

4、維起始沒有明顯作用，但隨著抑制劑濃度的增加纖維細(xì)胞的伸長受到抑制。推測，sPLA2可能主要參與調(diào)節(jié)纖維細(xì)胞的伸長。
　　2.GhPLA2α和GhPLA2β的克隆及表達(dá)特性
　　從棉花cDNA中克隆了sPLA2同源蛋白的編碼基因，分別命名為GhPLA2α和GhPLA2β。Real-time PCR結(jié)果表明，GhPLA2α在8～15dpa的纖維中的表達(dá)豐度最高，暗示GhPLA2α可能參與了纖維伸長的調(diào)控。相反GhPLA2β主要在

5、葉片和20～23dpa的纖維中有高豐度表達(dá)，暗示GhPLA2β可能參與纖維素的沉積。此外，將GhPLA2α的上游調(diào)控序列融合GUS報(bào)告基因構(gòu)建植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入番茄。GUS活性分析結(jié)果表明，該上游序列僅在發(fā)育的種子和種皮毛中有活性。
　　3.離體試驗(yàn)表明，GhPLA2α和GhPLA2β具有催化水解磷脂膽堿的功能
　　原核表達(dá)系統(tǒng)中，GhPLA2α和GhPLA2β與GST的融合蛋白能夠被IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。離體實(shí)驗(yàn)表明，GhPL

6、A2α和GhPLA2β能夠催化水解磷脂膽堿。GC-MS分析甲酯化的水解產(chǎn)物表明，GhPLA2α和GhPLA2β專一性催化水解磷脂膽堿的sn-2位?；?br>　　4.在胚珠外表皮中上調(diào)和下調(diào)GhPLA2α和GhPLA2β的表達(dá)
　　為明確GhPLA2α和GhPLA2β在棉花中的作用，利用胚珠表皮特異啟動子BAN在棉花中分別上調(diào)和下調(diào)GhPLA2α或GhPLA2β，電子顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因棉花發(fā)現(xiàn)，纖維在起始階段沒有明顯變化。但在纖維早