植物肽類激素PSK在棉花纖維發(fā)育中的功能研究.pdf

1、棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，棉花纖維是最重要的天然紡織工業(yè)原料。棉花纖維是由棉花胚珠外表皮的單細(xì)胞發(fā)育而成的表皮毛，從纖維細(xì)胞的突起到成熟的纖維需要45到60天，纖維的長度主要由快速伸長期決定。植物肽類激素PSK是一種能夠從植物細(xì)胞內(nèi)分泌到胞外磺化五肽，能由細(xì)胞膜上特異的受體感知，進(jìn)而引起一系列生理生化反應(yīng)，PSK信號在植物細(xì)胞伸長過程中起重要作用。PSK的作用機(jī)理研究較多，但在應(yīng)用于作物對產(chǎn)量或品質(zhì)進(jìn)行改良的研究至今還未見報(bào)道。PSK能促進(jìn)

2、細(xì)胞伸長，其是否能促進(jìn)棉花纖維伸長而改良棉花纖維品質(zhì)值得探究。本研究首先通過胚珠培養(yǎng)體系證明了外源添加PSK-α能夠顯著促進(jìn)棉花纖維的伸長，進(jìn)而克隆了棉花PSK基因，通過轉(zhuǎn)基因得到了纖維品質(zhì)在長度和細(xì)度方面得到改良的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因棉花，并對PSK信號在棉花纖維發(fā)育調(diào)控機(jī)理方面進(jìn)行了系統(tǒng)的分析研究。具體研究結(jié)果如下:
　　1、在胚珠培養(yǎng)體系中外源添加PSK能夠促進(jìn)棉花纖維的伸長。
　　在胚珠培養(yǎng)體系中，低濃度的PSK-α就能夠顯

3、著的促進(jìn)棉花纖維的伸長，這種促進(jìn)作用存在著劑量效應(yīng)，1μmol·L-1是最優(yōu)濃度。在含有GA3和IAA培養(yǎng)基中外源添加PSK-α(1μmol·L-1)對受精后的胚珠進(jìn)行培養(yǎng)，纖維長度能夠增加27％，在不含IAA的培養(yǎng)基中添加PSK-α，其對纖維伸長的促進(jìn)效果更加顯著，纖維長度能夠增加46％。PSK-α對未受精胚珠纖維發(fā)育的促進(jìn)更加顯著。氯酸鹽(KClO3)是多肽磺化的抑制劑，添加到胚珠培養(yǎng)的培養(yǎng)基中能夠抑制內(nèi)源PSK-α的產(chǎn)生而抑制胚珠

4、和纖維發(fā)育。外源添加PSK-α能夠部分的恢復(fù)KClO3對纖維發(fā)育的抑制作用，進(jìn)一步證實(shí)PSK的確能促進(jìn)纖維發(fā)育。
　　2、棉花PSK前體基因GhPSK的克隆和序列分析。
　　通過同源序列法從陸地棉纖維中克隆了一個(gè)棉花PSK基因，該基因編碼一個(gè)85氨基酸的PSK前體多肽，其氨基酸序列的C端包含了成熟PSK五肽序列(YIYTQ)。GhPSK和擬南芥的PSK4、PSK5相似度較高，和玉米、水稻的PSK序列差異較大。GhPSK在開花

5、后5到20天的纖維細(xì)胞中優(yōu)勢表達(dá)，在下胚軸、根和花瓣中也有著高量表達(dá)。為了驗(yàn)證GhPSK的功能，在擬南芥中異源表達(dá)GhPSK，轉(zhuǎn)基因擬南芥主根長度顯著增加，而且增加的程度和GhPSK的表達(dá)水平正相關(guān)。
　　3、在棉花中超表達(dá)GhPSK能夠改良纖維的長度和細(xì)度。
　　將GhPSK構(gòu)建RNAi干涉載體和35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的超表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因棉花。GhPSK在超表達(dá)株系中的表達(dá)豐度顯著提高，但是在RNAi株系中干

6、涉程度并不明顯?？疾焯镩g和溫室T2代株系纖維長度，GhPSK超表達(dá)較野生型顯著增長，但RNAi株系纖維長度變化不明顯。追蹤纖維發(fā)育進(jìn)程發(fā)現(xiàn)超表達(dá)GhPSK能夠在快速伸長期顯著增加纖維伸長速率。進(jìn)一步考察T3代GhPSK超表達(dá)純系纖維性狀發(fā)現(xiàn)超表達(dá)GhPSK不僅能夠提高纖維長度，還顯著改良纖維的細(xì)度。
　　4、GhPSK通過調(diào)節(jié)K+穩(wěn)態(tài)和ROS水平促進(jìn)纖維伸長。
　　通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對10DPA纖維中內(nèi)源PSK-α進(jìn)行定量，發(fā)

7、現(xiàn)超表達(dá)GhPSK能夠顯著提高纖維內(nèi)源PSK-α的水平。根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，PSK信號促進(jìn)纖維的伸長可能是通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)K+的水平，因此利用非損傷微測技術(shù)對GhPSK超表達(dá)株系和野生型對照10DPA纖維尖端的K+流進(jìn)行檢測，結(jié)果表明超表達(dá)株系纖維尖端的K+外流速率顯著低于野生型。為了驗(yàn)證GhPSK是否與K+有關(guān)，通過胚珠培養(yǎng)體系來檢測超表達(dá)GhPSK對外源K+反應(yīng)，在低濃度和適宜濃度的K+處理下，GhPSK超表達(dá)株系的纖維長度較野生型顯著增

8、加，然而在高濃度的K+條件下，二者纖維長度的差異不明顯。這些結(jié)果說明了PSK-α信號可以通過直接或間接的方式影響纖維細(xì)胞中K+的穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而影響纖維的伸長。進(jìn)一步采用Solexa測序來研究GhPSK調(diào)控纖維發(fā)育的路徑，對比超表達(dá)株系和野生型（10DPA纖維）表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)有132個(gè)差異表達(dá)基因。PSK信號還可能通過影響調(diào)節(jié)細(xì)胞ROS水平的基因表達(dá)從而促進(jìn)纖維細(xì)胞的快速伸長。
　　5、PSK受體基因GhPSKR的克隆、序列分析以及轉(zhuǎn)基因

9、后代分析。
　　以擬南芥的PSKR序列進(jìn)行BLAST，在棉花EST數(shù)據(jù)庫搜索到一條同源序列GhPSKR，通過5'-RACE擴(kuò)增到一條3296bp具有完整ORF的cDNA，其編碼1013個(gè)氨基酸，具有膜定位信號肽、富亮氨酸結(jié)構(gòu)域(LRR)、PSK結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和受體激酶結(jié)構(gòu)域等典型的PSK受體結(jié)構(gòu)域。該基因和蓖麻、擬南芥和胡蘿卜的PSKR相似性最高，而和水稻中的PSKR有一定的差異。GhPSKR在棉花的根、下胚軸和次生壁合成